快速操作指南

注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项

1.使用前检查 Pre-Wash Buffer及Lysis Buffer F1 是否有沉淀，若有请在55 ˚C加热至完全溶解后使用。

2.Binding Buffer FS 使用前加入35 mL异丙醇（试用装加3.5 mL），并在标签上做标记。

3.Wash Buffer FS1 使用前加入21 mL乙醇（试用装加2.1 mL），并在标签上做标记。

4.Wash Buffer FS2 使用前加入50mL乙醇（试用装加5.0 mL），并在标签上做标记。

5.准备100个2.0 mL离心管（试用装准备10个2.0 mL离心管）。

6.如果没有Fastprep仪器，可使用涡旋震荡仪（推荐搭配相应适配器），以最大速度涡旋10 min来裂解样本。

7.14000 x g是推荐的离心速度，若离心机达不到可采用其最大速度离心。

裂解：     

     1    向Lysing Matrix E中加入30-200 mg粪便样本。

           可选步骤：对杂质含量高的粪便样本可增加预洗步骤，向样本中添加1mL Pre-Wash Buffer， 以最大速度涡旋混匀40 s，14,000 x g离心5分钟，弃上清留沉淀。

     2    向粪便样本或者预洗过的沉淀中加入980 µL Lysis Buffer F1，120 µL Lysis Buffer F2和 10 µL RNase A Solution，涡旋混匀10 s。

     3    使用FastPrep样品制备仪，5.0 m/s 研磨40 s，或采用涡旋震荡仪最大速度研磨10 min。

           备注：以上研磨条件适合于大多数样本，但个别样本需要的研磨速度和时间需要尝试后确定。

     4    14,000 x g，离心5 min。

去杂：

     5    小心地吸取上清液（约800 µL）转移至新的2.0 mL离心管（自备）。

     6    向离心管中加入250 µL Inhibitor Removal FS ，颠倒混合10次。

     7    1,4000 x g，离心5 min。

结合：

     8    小心地吸取上清液900 μL，转移至新的2.0 mL离心管（自备）。

     9    向离心管中加入900 µL Binding Buffer FS ，涡旋混匀。

     10   将结合柱Column F1 装入配套的2.0 mL收集管，向Column F1中加入800 µL 上述混合液。1,4000 x g，离心30 s，倒掉收集管中液体，再次安装好收集管。重复一次本步骤。

漂洗：

     11   向Column F1中加入500 µL Wash Buffer FS1，1,4000 x g，离心30 s，倒掉收集管中液体，再次安装好收集管。

     12   向Column F1中加入500 µL Wash Buffer FS2，1,4000 x g，离心30 s，倒掉收集管中液体，再次安装好收集管，重复本步骤一次。

     13   不加任何试剂，1,4000 x g，离心2 min。

干燥：

     14   将丢弃2.0 mL收集管，将Column F1装入配套的1.5 mL收集管。

     15   将Column F1在室温条件干燥5 min。

     16   DES Buffer 提前置于 55 ˚C 预热。

洗脱：

     17   向Column F1柱膜中央加入100 µL 55℃预热的DES Buffer，1,4000 x g，离心1 min。

     18   1.5 mL收集管中液体即为洗脱DNA，可应用于下游实验，长期保存请置于-20˚C ， 避免反复冻融。