作者：张国英 杨慧 刘明社 张芸 赵中夫

【关键词】  阳离子脂质体META;HepG2细胞;RNA干扰;AFP

    摘 要  目的:筛选较理想的阳离子脂质体META/pGenesil-AFP质粒转染HepG2的方法。方法:将针对两条靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板双链，连接于质粒表达载体，构建质粒载体pGenesil-1-AFP1（含绿色荧光蛋白GEP编码序列）及pGenesil-2-AFP2，用阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1转染HepG2细胞。荧光显微镜观察并计算不同剂量配比的脂质体/质粒载体混合液转染效果及微粒子化学发光免疫分析法检测不同剂量配比转染后对AFP基因表达的影响。结果:剂量比为8μL∶2.5μg条件，能有效地转染HepG2细胞，并有效抑制AFP表达且无细胞毒性作用。结论:本研究成功建立了阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1转染HepG2细胞实验方法。

    关键词  阳离子脂质体META;HepG2细胞;RNA干扰;AFP

    近年来发现的RNA干扰技术（RNAi）被认为是最有效基因敲除方法。实施siRNA对靶序列的抑制，成功地将双链RNA转染到细胞内是实验的关键。本研究将针对两条靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板双链，连接于质粒表达载体，构建质粒载体pGenesil-1-AFP1（含绿色荧光蛋白编码序列）及pGenesil-2-AFP2，用阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1对HepG2细胞进行了转染实验研究，拟筛选较理想的阳离子脂质体META/pGenesil-1-AFP质粒转染HepG2的方法。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    高糖型DMEM培养基由美国GIBCO公司提供;胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供;L-谷氨酰胺由北京化学试剂公司提供;META-FECTENE 转染试剂由德国BIONTEX提供;质粒载体pGenesil-1-AFP1、pGenesil-2-AFP2由武汉晶赛生物工程有限公司协助合成;AFP化学发光免疫分析试剂盒由美国BECKMEN提供;人肝癌细胞HepG2由北京大学感染科病毒研究室惠赠，本室传代。

    1.2 方法

    1.2.1  目标基因序列的选择及载体构建:以人肝癌细胞HepG2细胞AFP基因作为作用靶点（geneID:174），合成两条AFP-shRNA，分别为 AFP-1，AFP-2，经BLAST软件查对及序列同源性分析，确定目标基因序列为:AFP-1:1275i-GCATTG- GCAAAGCGAAGCT-，AFP-2:694i-GCAGCU-UGUUAAAUCAACA-阴性对照（HK）:-GACTTCATAAGGCGCATGC-，构建质粒载体pGe-nesil-1-AFP1插入的DNA模板序列（包含GFP编码 序列）:5′- GATCCGCATTG-GCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTT-GCCAATGCTTTTTTGTCGACA-3′ ，3′-GCGTAAC-CGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAAC GGTTACGAAAAAAC AGCTGTTCGA-5′，构建质粒载体pGenesil-2-AFP2插入的DNA模板序列为: 5′ - GATCCGGTCTTACA-TAAGAGGACTTTCAAGACGAGTCCTCTTATGT AA-GACCTTTTTTGTCGACA-3′，3′-GCCAGAATG-TATTCTCCTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATT CTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，构建质粒载体pGenesil-2-HK插入的DNA模板序列为:5′ -GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACG-GCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3′ ，3′-GCTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCC GTACGCGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，载体质粒的构建及酶切鉴定、DNA序列分析由武汉晶赛生物工程公司协助完成，浓度为2.5μg/μL。

    1.2.2  待转染HepG2细胞的培养和准备:HepG2细胞生长于含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基中，并在37℃、5%CO 2 孵箱中进行培养。转染前选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后吹打成单细胞悬液，以4×10 5 密度转种于放置了无菌盖玻片的6孔培养板中，每孔2mL。24h后观察细胞生长，铺满孔底面积约60%时用于转染。

    1.2.3  转染试剂META/质粒载体混合液配制及转染:剂量配比在其建议范围（2∶1～7∶1）内选择设计，按META/pGenesil配比分六组，分别为空白对照组，3μL∶1μg组，6μL∶1μg组，8μL∶2.5μg组，12μL∶2.5μg组，15μL∶5μg组，每组设三个复孔。用 pGenesil-1-EGFP-AFP1进行实验，以便荧光显微镜下观察转染效果。

    取10支无菌1.5mL EP管，作好标记:取9μL，18μL，24μL，36μL，45μL脂质体分别加入A1，A2，B1，B2，C1管中;迅速加入无抗生素无血清的 DMEM培养基，使得各管中总体积为300μL，轻轻混匀。a1，a2管中各加1.2μL pGenesil-1-EGFP-AFP1;b1，b2管中各加3μL;c1管中加6μL;然后各管中迅速加入无抗生素及血清的DMEM培养基，使得各管中总体积为300μL，混匀。将管A1、A2、B1、B2、C1中的脂质体对应加入a1、a2、b1、b2、c1管中，轻轻混匀。室温下静置20min。取出培养板将板中培养液弃去，用无血清及抗生素的DMEM培养基冲洗培养板两次后，留出三孔作为空白对照，每孔加1mL无血清及抗生素的DMEM培养基，其余各孔各加0.8mL。除空白对照外，每三孔加入相同剂量配比的META-pGene复合物各200μL，混匀。将培养板置于CO 2 孵箱中培养8h后，吸出孔中DMEM，每孔加入含10%胎牛血清的完全DMEM继续培养。培养24h后吸出细胞培养上清液，将盖玻片用PBS洗涤两次后置于荧光显微镜下观察，记录不同剂量配比的转染效果。

    1.2.4  细胞培养上清液中AFP的检测:转染后24h，对各孔AFP进行检测。采用微粒子化学发光免疫分析法，美国BECKMEN公司试剂盒操作。

2 结果

    2.1 不同剂量配比的META/质粒载体混合液转染效果荧光显微镜下，我们观察到不同剂量配比的阳离子脂质体有不同的转染效果，表达绿色荧光蛋白的为被转染细胞。为了计算不同配比阳离子 META的转染率，在不同配比的转染组的盖玻片上各选择3个视野，计数细胞，计算阳性细胞的平均百分率。以此筛选RNAi实验的最适META/质粒载体比例。见表1。表1 不同配比脂质体转染试剂转染率（略）在不同配比试剂的转染组中，8μL∶2.5μg组和12μL∶2.5μg组转染效率较高，且两者之间无显著性差异（P>0.05）;但显著高于3μL∶1μg组和6μL∶1μg组（P<0.01）。因15μL∶5μg组多数细胞发生崩解呈碎片样，无法观察到转染效果，未列入统计表中。

    2.2 不同剂量配比组转染后对AFP基因表达的影响 转染后24h，对各孔AFP进行检测，结果显示与转染率相一致的抑制作用，3μL∶1μg组和6μL∶1μg组与不做转染的空白对照组相比，AFP含量无显著性变化。8μL∶2.5μg组与12μL∶2.5μg组的AFP含量无明显差别（P>0.05），但均较空白对照组和低浓度组减少（P<0.01）。见表2。 表2 不同配比转染组对AFP表达的影响（略）根据以上实验结果，我们选用剂量配比为8μL∶2.5μg的META/质粒载体混合液为最佳条件配比。

    3 讨论

    哺乳动物细胞基因转染有多种方法 ［1］ ，在早期siRNA研究中多应用磷酸钙共沉淀法，但此方法转染效率低且对很多细胞株无效。以后有人利用阳离子脂质体在水中可形成微小的带正电的单层脂质体，靠静电作用结合到核酸分子的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面，被俘获的核酸分子就会被导入细胞原理，采用阳离子脂质体法进行转染研究，此方法虽操作简便，转染效率高，但易产生高水平细胞毒性 ［2］。近几年出现的新一代脂质体―多聚阳离子脂质体，可以浓缩DNA，将DNA运送到细胞内并使其在细胞核内释放，而且细胞毒性低，稳定性好，转染效率高（可达磷酸钙沉淀法的5倍～100倍）。本实验中，我们将编码siAFP的DNA模板插入pGenesil-1质粒载体，构建出pGenesil-1- AFP。这种质粒以pEGFP-C1改造获得，用阳离子脂质体包裹质粒载体转染细胞后，被转染细胞可以表达绿色荧光蛋白。在荧光显微镜下可以直接观察到转染成功的阳性细胞发出明亮绿色荧光。通过计数视野中阳性细胞和总细胞数可以计算出转染率。结果发现，不同剂量的转染试剂能将不同浓度比例的质粒载体转入细胞，以转染试剂:质粒载体为8μL∶2.5μg组与12μL∶2.5μg组的转染组转染效率最高，均可达到50%左右，两组转染效率无显著差异，但后者细胞活性明显下降，而增加转染试剂浓度比值至15μL∶5μg组中的细胞则发生溶解，说明多聚阳离子脂质体剂量过大也可能对细胞产生毒性作用。提示剂量比为 8μL∶2.5μg条件，能有效地转染HepG2细胞，且无细胞毒性作用。(论文下载网 www.lunwenda.com )

    甲胎球蛋白（AFP）是人类发现的第一个真正有价值的肿瘤标志物，长期以来，一直认为AFP仅可用于原发性肝癌（HCC）的诊断。近年来，随着分子生物学技术、免疫学技术及细胞间信号转导研究的发展，有关学者通过实验证实AFP有促进肿瘤细胞增殖的重要生物学作用 ［3，4］ 。RNAi能高效、特异、持久抑制基因表达，对由于基因表达异常增高引起的疾病中有重要的应用前景。先前应用RNAi技术抑制有关基因表达的实验，大多采用体外转录合成siRNA或构建siRNA表达载体与靶基因表达载体共同转染目标细胞的方法，单独观察靶基因表达受抑效果，这种方法虽可以准确检测到siRNA特异地抑制基因表达作用 ［2，5，6］ 。但目前的转染方法并不能保证试验体系中所有细胞均被转染，不符合活体内发生肿瘤的自然状态。因此，试验结果距应用研究还有一定差距。本研究以HepG2细胞为研究对象，使转染和未被转染的细胞在同一体系中培养，在转染效率达50%左右后，不去除未被转染的细胞，观察AFP基因表达抑制情况。这种试验方案不仅比较接近机体发生肿瘤的自然状态，而且可以更好地评价siRNA特异地抑制AFP基因表达的作用。

    参考文献

    ［1］ Shlomai A，Shaul Y.Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference［J］.Hepatology，2003，37（4）:764～ 770.

    ［2］ Giladi H，Ketzinel-Gilad M，Rivkin L，et al.Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice［J］.Molecular Thera-py，2003，8（5）:769～776.

    ［3］ Li MS，Li PF，He SPet al.Promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel7402line cellsJ］.World Gastrunal，2002，8（3）:467～472.

    ［4］ 康晓燕，殷正丰，钱海华，等.肝癌患者外周血甲胎蛋白异质体和转录物含量的相关分析［J］.中华肝脏病杂志，2003，11（1）:17～19.

    ［5］ Novina CD，Murray MF，Dykxhoorn DM，et al.siRNA-direct-ed inhibition of HIV-1infection［J］.Nat Med，2002，8（7）:681～686.［6］ Jacque JM，Triques L，Stevenson M.Modulation of HIV-1replication by RNA interference［J］.Nature，2002，418:435～438

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