陈连旭 综述 于长隆审阅
北京大学运动医学研究所，北京100083
摘要：RNA干涉(RNA interference)是指由特定双链RNA（dsRNA）引起的转录后基因沉默现象,是目前分子生物学、细胞生物学和遗传学的研究热点，为人们研究基因功能提供了一个有力工具。siRNA(small interference RNA)是RNAi的起始诱导物，在细胞内引起强烈的RNAi,降解目的基因的mRNA，以控制目的基因的表达。转录因子NF-kB是介导许多免疫和炎症的中心物质 ，在介导骨性关节炎形成的许多细胞因子中，发挥关键的作用 。本文只在回顾近来在RNAi,NF-kB和骨性关节炎中细胞因子的研究进展，探讨RNAi技术应用骨性关节炎的治疗。
关键词： siRNA；NF-kBp65；基因治疗；骨性关节炎；细胞因子
一、RNAi技术
RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成了生命的框架。最近因其能干涉生物基因表达而颇受瞩目，并且由此而引发的RNA干扰。RNAi(RNA interference)即RNA干扰，自从1998 年被阐明以来，一直是分子生物学、细胞生物学和遗传学的研究热点。从植物、真菌到线虫乃至哺乳动物和人类，RNAi研究方兴未艾。
RNAi的发现
早在10多年前，植物学家在研究转基因植物时就发现，部分外源基因导入植物后，不但未能正常表达，植物自身的等位基因表达也受到抑制，即所谓共抑制（cosupression）现象。此后，在酵母菌和线虫研究中也发现类似现象，称之为缓解（quelling）。这种基因抑制是发生在转
录后水平的，因此又称为转录后基因沉默(post-transcription gene silencing PTGS)[1]。Fire等［2］在利用反义RNA进行线虫基因阻断时，发现双链RNA能够引起mRNA降解，而且这一效应是基因特异性的。此后，越来越多研究证实，共抑制、缓解和转录后基因沉默，都存在由双链RNA 介导mRNA降解的共同机制—-在生物体内，当外源性或内源性双链RNA（double-stranded RNA dsRNA）进入细胞后，识别含有其互补序列的RNA并与之结合后，在酶的作用下降解mRNA，从而干扰相应基因表达。Fire将这一现象称为RNA interference(RNAi)。这是一种广泛存在于生物界的古老的现象，早在动植物分化之前的生物体内就已经产生了。RNAi在生物抵御病毒感染，维持基因组中转座子的稳定以及某些生物生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。
RNAi的分子机制
随着研究的深入，科学家对于RNAi的发生机制已达成了初步共识：外源性（如病毒）或内源性的dsRNA在细胞内与一种RNA酶3（RNAase 3 endonucleasee）—Dicer结合，随即被切割成21-23 nt的，带有3’端单链尾巴及磷酸化的5’端的21-23 nt的短链dsRNA，是RNAi的起始诱导物，即siRNA（small interference RNA）。siRNA与Dicer形成RISC复合体（RNA induced silencing complex)。siRNA作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体结mRNA。随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21-23 nt的片段，特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的双链RNA片段可再次形成RISC复合体，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。因此，每个细胞只需要几个siRNA分子就能够引起强烈的RNAi效应[3]。此外，siRNA还可以在RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase RDRp）的作用下进行大量扩增，并转运出细胞，使siRNA扩散到整个机体并可以传代[4]。
RNAi作用机制示意图：
RNAi与基因功能研究
人工诱导RNAi技术的建立，为人们提供了一种高效的基因功能研究方法。有人将绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein GFP）导入斑马鱼胚胎后，通过显微注射将针对GFP序列的dsRNA注入细胞，结果GFP基因受到抑制，而同时转入的其他基因不受影响。注入针对控制脊索或眼睛发育基因的dsRNA后，胚胎发育成无尾或无眼的斑马鱼。这说明在脊椎动物中，内源和外源性基因都可以被其同源的dsRNA特异性抑制，并产生基因缺失表型。Tuschl实验组将体外构建的dsRNA分别导入Hela细胞（人类宫颈癌细胞）、大鼠成纤维细胞和小鼠3T3细胞，分别抑制了哺乳动物LaminB1,LaminB2,NUP153,GAS41,ARC21,cdk1,b-actin和r-actin，等21个不同类型基因，均获得成功，并重新界定了部分必须基因和非必须基因[5]。RNAi抑制作用有严格的序列特异性，即使一个碱基的错配，也会严重影响抑制效果。与传统的基因功能的研究方法相比，RNAi技术灵敏、可靠、结果稳定，操作便捷，费用相对较低，很适合用于大规模筛选，定位新的功能基因。
哺乳动物细胞中的RNAi研究
RNAi技术已成为生物基因功能研究有力工具。然而在哺乳动物细胞中，超过30nt的dsRNA会启动一种自身细胞毒机制，使大量mRNA非特异性降解，引起细胞死亡。为了克服这一障碍，Tuschl和他的同事将体外合成含有19个碱基对和2-3 nt的3’端单链尾巴的短链siRNA，通过脂质体转染，导入哺乳动物细胞后，成功诱导RNAi。但是，在一些类型的细胞中，只能对靶基因产生瞬时抑制效应[6]。于是学者们构建了的以DNA为模板的siRNA表达载体。将19nt的目的序列及其反向重复序列插入含有启动子质粒染色体，同时插入作为检测标志的报告基因（reportor）如GFP。该表达载体转染细胞后，能够转录出含有19个碱基对的茎环状（发夹状）siRNA,诱导RNAi，有效抑制目的基因[7]。表达载体的方法将合成siRNA的过程转移至细胞内进行，不但效率大大提高，而且可以排除RNA酶的干扰，延长siRNA的半衰期[8]。更重要的，随着载体质粒的复制、扩增，siRNA扩散到整个机体，基因抑制效果能够传代。这一方法的应用，使siRNA技术应用，进入了新阶段。
siRNA与基因治疗
与基因替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统的基因治疗方法相比，siRNA技术有着无可比拟的优势。首先，RNAi基因抑制效果确切。微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上，达到剔除（knock-out）的效果。其次，RNAi抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，副作用小。在抗病毒研究中，Lee等[9]在HVI-1病毒基因组的rev和tat基因中分别选取21nt的序列为靶点，进行RNAi抑制，5d后检测HVI-1的p24抗原下降达90%，细胞的生长未受影响。针对脊髓灰质炎病毒和丙型肝炎病毒的体外RNAi抑制实验，也可以显著降低培养人类细胞中的病毒滴度。美国冷泉港实验室的McCaffray AP 研究组，第一次在活体大鼠体内成功诱导了RNAi，使其肝脏内的HCV含量平均下降81%[10]。肿瘤是多基因、多因素疾病，单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果。RNAI技术能够同时抑制多个不同基因,而且抑制效果互不干扰。此外，RNAi识别可以精确到一个核苷酸，对由野生型点突变形成的癌基因，如ras，p53等，能够产生准确有效的封闭效果，野生型基因则不受影响。实验证明，bcl-2，CDK-2，PLK-1,p53等肿瘤相关基因的RNAi抑制，能够使人类宫颈癌细胞（hela）增殖速度减慢，恶性程度降低，凋亡加快。肝癌（Hep3B）、非小细胞肺癌（HI299）、头颈部鳞状细胞癌（C33-A）、骨肉瘤（U-2OS）及前列腺癌（LNCaP）[11]、白血病[12]等细胞系中的实验也发现类似效应。此外，将RNAi应用于wils0on病等先天遗传性疾病的体外实验也获得令人满意的结果[13]。H.W.Zhou等[14]利用siRNA技术在骨性关节炎的软骨细胞抑制p16基因，获得满意效果，这也是首次在软骨细胞中应用RNAi技术，提示我们可以在骨科领域应用RNAi技术。
二、核因子kappaB
核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-kB)是1986年由Sen和Baltimore首次从B淋巴细胞中监测到的一种能与免疫球蛋白k轻链基因增强子kB序列特异结合的核蛋白因子[1]。NF-kB是普遍存在于真核细胞中的一种快反应转录因子，在静息状态下与抑制性蛋白IkB结合并以非活性状态存在于胞浆内。抑制状态的NF-kB对环境变化比较敏感，可被多种刺激激活，转入核内调节一系列基因的表达。NF-kB对大量基因的调节，在机体的正常生理状态和各种疾病的病理发生机制都发挥着重要的作用。它不仅参与机体正常的免疫和炎症反应、发育、细胞的生长和调亡过程，同时它与癌症、关节炎、哮喘、心血管疾病也有密切的联系。
NF-kB的结构
NF-κb是属于Rel家族的二聚体蛋白，具有300核苷酸的同源结构域：Rel同源结构域(Rel Homology Domain,RHA)，内含DNA结合域、二聚化结构域和核定位信号（nuclear translocation signal,NLS）区，分别具有与DNA上的kB序列结合，与同源或异源亚基形成二聚体，与NF-kB抑制蛋白IkB家族成员相互结合等功能。大多数二聚体包括P65（Rel A）和P50两种蛋白，其他Rel家族的蛋白如：c-ReL,Rel B、v-Rel、P52也有可能以不同的方式跟它结合。不同形式的二聚体可能选择激活不同的基因，具有不同的转录活性。RelA、RelB和c-Rel的C端含有转录激活域（transactivation domain）,其中富集丝氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸，能直接作用与转录元件而激活转录过程，而p50和p52无此结构。NF-kB/Rel蛋白家族均以同源或异源二聚体形式存在，其中以p50/RelA最普遍，几乎存在于所有的细胞中。p50亚基用于与DNAkB序列结合，而RelA亚基即可利用其C端的转录激活域增强靶基因的转录激活，又可与各种Ikb成员直接藕联[2]。
IkB抑制蛋白家族包括IkBa、IkBb、IkBr、IkBe、p100、p102、Bcl-3和IkB-R[3]。其中IkBa和IkBb时NF-κB活性的主要调节者。它们享有三个共同的结构特征：都有一个N末端调节域，与信号诱导的IκB蛋白降解有关；都有6个获7个锚定蛋白重复区，可与RHD结合而隐藏NF-kB的NLS,从而阻止NF-κB的核移位；IκB的C端富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的羧基末端片断（PEST）基序，该基序在抑制NF-κB与DNA的结合中发挥作用。
NF-κb正常情况下跟阻滞蛋白IκB结合，以非活性方式存在与细胞质中，IκB分子具有ankryn样的重复序列，同不同的Rel蛋白结合，覆盖核转录信号位点。当有外源激活信号时，通过一系列酶的作用,IκB磷酸化，脱离多聚体，而使NF-κB暴露转录位点而进入核内，结合到Rel蛋白的顺式作用结合位点（GGGRNNYYCC），发挥转录因子的作用,促进基因的转录[4]。转录结束后，NF-kB与新合成的IκB结合出核并再次失活。外源激活刺激包括：前炎细胞因子（IL-1β,TNF-α,IL-11,IL-17）、脂多糖，蛋白激酶C、氧化剂、各种病毒及某些理化因素等。NF-κB激活后，快速诱导包括免疫反应和炎症反应在内的多基因表达,主要包括细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-11、IL-17)，化学因子（IL-8等）,炎性酶（iNOs和iCOX-2）、黏附因子（ICAM-1,VCAM-1），生长因子(VEGF)，凋亡相关因子p53和某些受体。既然NF-kB可以调节IL-1β和TNF-α表达，也可被它转录激活，在某些细胞中随着NF-κB的慢性激活，可导致前馈性扩增。NF-κB不只是单独作用，而是跟其他转录因子如：AP-1、ATF和C/EBP共同作用，扩大基因表达。
靶向性破坏NF-κB的组成元件，在其转录过程中发挥重要作用，敲除RelA的大鼠不能存活，敲除p50的基因导致对感染的易感，破坏IkB导致延长NF-κB的激活、感染的刺激，动物由于广泛感染而死亡。如果抑制NF-κB的活动，可以减轻免疫反应和炎性介质的释放，激素、阿司匹林和金制剂都是它的抑制剂，已广泛应用于临床。拮抗p65的反义寡核苷酸已用于试验和临床研究中。它能抑制大多数炎细胞因子的表达，减轻炎症反应，减轻组织破坏。
三、骨性关节炎的细胞因子学说
近年来的研究表明，细胞因子和多肽生长因子不仅在关节软骨和滑膜的正常结构和功能的维持方面起重要作用，而且，一些因子在关节炎的病理过程中对关节软骨和关节滑膜也具有一定的破坏作用。在OA发生中最引人注目的是IL-1β、TNF-α两种细胞因子，IL-1β 和TNF-α是关节炎病理过程中促进软骨机制降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子。大量证据表明，IL-1b在关节炎的病理生理过程中发挥重要的作用，通过一系列反应，导致关节炎症和软骨的破坏[1、2]。在关节软骨中，IL-1可阻止软骨基质蛋白的形成 [3、4]，诱导软骨细胞产生基质金属蛋白酶[5]，介导金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）与金属蛋白酶（MMPs）之间失衡，降解软骨基质成分。还可诱导产生炎性介质，包括前列腺素（PGE）[6]和一氧化氮(NO)[7],导致关节的肿胀和疼痛。由诱导性一氧化氮合酶（iNOS）产生的一氧化氮(NO)在关节炎疾病的病理生理过程中发挥重要的作用。而阻止一氧化氮的合成，可抑制一些关节炎的发生[8、9]。在关节中，NO主要有软骨细胞和滑膜细胞产生[10]，对IL-1β和TNF-α等刺激敏感，这些刺激主要加快iNOS的表达和合成，以增加NO的产量[12、13]，iNOS蛋白的合成调节主要在转录水平，主要包括NF-kB和AP-1[13-18]。但A. Ferreira Mendes等[19]认为，NF-κB和p38是主要的两条相互独立的诱导iNOS表达的转录通路，阻止其中的任何一条，都足以阻止iNOS的表达，减少关节软骨细胞内NO的含量。而前列腺素的增加与COX-2活化有关，主要与NF-κB调节有关，而干扰其活性可显著降低COX-2的表达，进一步降低前列腺素的合成[20]。在软骨组织中，TNF-α选择性地抑制Ⅱ型和Ⅸ型软骨胶原的产生，抑制蛋白多糖的合成，同时促其降解，另外，对PA、PGE2、和IL-6均有诱导作用，与OA软骨破坏及滑膜炎有关。OA软骨与正常软骨相比，产生更多的TNF-α和TNF-α转换酶（TNF-alpha convertase enzyme，TACE）mRNA，TACE是TNF-α的活性调节剂。从OA关节软骨中分离的软骨细胞中p55 TNF 受体(TNF-R)高表达。在神经细胞中，抑制NF-κBp50可抑制p53和NO的表达，可抑制神经细胞的凋亡。有作者认为，TNF-α是IL-1β的上游因子，可诱导IL-1β的产生并共同作用，在骨性关节炎的早期发挥作用。
小结
骨性关节炎的主要致病因素使IL-1β和TNF-α,二者都可通过NF-κB转录因子介导的通路激活MMPs,iNOS和COX-2,引起软骨损伤和关节炎症状。而且还进一步反馈增加IL-1β和TNF-α的转录表达。因此应用特异性的siRNA阻抑p65蛋白的表达，从而降低NF-κB的转录表达活性，抑制上述炎性介质的表达，达到治疗骨性关节炎的目的。同时在软骨细胞中对NF-kB与p53的凋亡作用也进行初步的研究，为下一步的工作创造条件。
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