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一.ELISA标准操作要点
优质的试剂良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件ELISA中用的蒸馏水或去离子水包括用于洗涤的应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm 1.标本的采取和保存 大部分ELISA检测均以血清为标本血清标本可按常规方法采集应注意避免溶血红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质以HRP为标记的ELISA测定中溶血标本可能会增加非特异性显色血清标本宜在新鲜时检测如有细菌污染菌体中可能含有内源性HRP也会产生假阳性反应一般说来在5天内测定的血清标本可放置于4℃标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合使间接法的试剂本底加深超过一周测定的需－20℃保存冻结血清融解后蛋白质局部浓缩分布不均应充分混匀并避免产生气泡混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤澄清后再检测反复冻融会使抗体效价跌落所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测宜少量分装冰存保存血清自采集时就应注意无菌操作也可加入适当防腐剂. 抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂. 2.加样 加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部避免加在孔壁上部并注意不可溅出. 3.保温 在建立ELISA方法作反应动力学研究时实验表明两次抗原抗体反应一般在37℃经 1-2小时产物的生成可达顶峰为避免蒸发板上应加盖也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔反应板不宜叠放以保证各板的温度都能迅速平衡应注意温育的温度和时间应按规定力求准确由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成采用水浴会造成值偏高或花板另外温育中还有边缘效应边上的值会偏高建议为了客观的判断结果将质控放在非边缘位置. 4.洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤但却决定着实验的成败ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来可以说在ELISA操作中洗涤是最主要的关键技术应引起操作者的高度重视操作者应严格按要求洗涤不得马虎. 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的非离子型洗涤剂既含疏水基团也含亲水基团其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合从而削弱蛋白质与固相载体的结合并借助于亲水基团和水分子的结合作用使蛋白质回复到水溶液状态从而脱离固相载体洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20其浓度可在0.05%-0.2%之间高于0.2%时可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度 洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用如果洗液需要稀释应按要求稀释所用的水电导率最好在1.5us/cm之下洗液如果结晶应待其融解后配制保证洗板浸泡时间为40秒左右孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好手工洗板防止洗液在孔内形成气泡. 5.显色和比色 TMB经HRP作用后约40分钟显色达顶峰随即逐渐减弱至2小时后即可完全消退至无色TMB的终止液有多种叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪是目视判断的良好终止剂此外各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值酶标比色仪简称酶标仪通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计酶标仪的主要性能指标有：测读速度读数的准确性重复性精确度和可测范围线性等等优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001准确性为±1%重复性达0.5%酶标仪不应安置在阳光或强光照射下操作时室温宜在15~30℃使用前先预热仪器15-30分钟测读结果更稳定 测读A值时要选用产物的敏感吸收峰如OPD用492nm波长有的酶标仪可用双波长式测读即每孔先后测读两次第一次在最适波长（W1）第二次在不敏感波长（W2）两次测定间不 移动ELISA板的位置最终测得的A值为两者之差（W1-W2）双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰. 二.本底及假阳性产生的原因分析
1.基因工程抗原与合成肽抗原的区别 1.1基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统该类抗原与合成肽相比具有以下特点： a.分子量大合成肽采用化学方法制备由于工艺的局限合成数量有限只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原分子量更大 b.稳定性好包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4个月采用基因工程抗原后效期大大延长了 c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达表达产物包含更多的抗原决定簇可提高试剂盒的灵敏度提高检出率 d.纯化难度大基因工程抗原的纯化技术难度较大 1.2合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段合成肽抗原有以下特点： a.分子量太小 b.一般只含有一个抗原决定簇 c.纯度高 d.稳定性差 由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡就HCV ELISA试剂盒来讲第一代产品为合成肽抗原主要是HCV特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽只是当时的基因工程抗原不全仅包括了HCV的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原而且这些抗原包括更多更稳定纯度更高的HCV特异性抗原第三代试剂的敏感度大大提高了 由于历史的原因人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被该类试剂盒的流行病学敏感度不够稳定性也成问题值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度科学得对待反应结果 2．假阳性本底产生的原因 2. 1抗原因素 2.1. 1融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响以丙肝诊断试剂盒为例为例因为包被的基因工程抗原为融合蛋白包含了来自表达载体的一些序列因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本. 摘自《检验医学在线》 |
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