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ELISA试剂组成

作者: 来源: 发布时间: 2009-12-04 11:19  浏览次数:
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 1.抗原  在ELISA中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有3类,即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。自然抗原的纯度不高,特异性不强;合成抗原一般为多肽片段,缺乏天然抗原所具有的立体结构表位,亲和力不高,可能导致相应表位的抗体漏检;基因重组抗原具有安全、特异性强、亲和力高、产量大等特点,是一种比较理想的抗原,但其纯化比较困难。

 
    2.抗体  在ELISA中应用的抗体可分为多克隆抗体(多抗)和单克隆抗体(单抗)。多抗取白免疫动物的抗血清,制备较简单,但抗血清成分复杂,除含针对抗原(多个表位)的抗体外,还含有多种其他抗体,亲和力和特异性相对要低于单抗,且制备周期长,批间差异较大。而单抗仅针对抗体的单一表位,亲和力和特异性均较多抗高,且制备技术成熟,产量大,批间差异小,但结合位点的单一也正是其弱点之所在,在双抗体夹心法中,如包被和指示抗体使用同一单抗,则由于结合位点的缺乏,容易造成假阴.性结果。在使用双单抗一步法时,应注意抗原过剩时的“钩状效应"
 
    3.和底物  在ELISA中最常用的酶为HRP和ALP。
    (1)HRP:是一种糖蛋白,含糖量约18%,分子量为44kD,在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素) 结合形成一种卟啉蛋白质。主酶为五色糖蛋白,在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环,是酶的活性基团,在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用纯度值(reinhartzahl,RZ)表示,RZ=A403nm/A275nm,即403nm的吸光度与280nm的吸光度之比,高纯度HRP的RZ值应≥3.0。HRP质量的另一重要指标是酶活力,以单位(unit,U)表示。用于标记的HRP比活性应≥250U/mg。HRP的作用底物为H202,催化下列反应;
DH2+H202  HRP  D+2H2O
   上式中DH2为供氢体(即底物),H2O2为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高,除H2O2外,仅作用于小分子醇和尿素的过氧化物。HRP的底物有多种,在ELISA中常用的有:邻苯二胺(orthophenylenediamine,OPD),四甲基联苯胺(3,3,5,5- tetramethyl-benzidine,TMB)和2,2,-连氮基-双-3-乙基苯噻唑啉磺酸盐[2,2,-azino-bisc(3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6),ABTS]。三者各有优缺点:OPD是在ELISA中应用最多的底物,灵敏度高,比色方便,但配成溶液后稳定性差,且有致异变性;TMB经酶作用后由五色变蓝色,加酸终止反应后显黄色,目测对比鲜明,可比色定量,溶液的稳定性也较差,但无致异变性,因此应用日见增多;ABTS虽然灵敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。
    (2)ALP:是一种磷酸酯的水解酶,用做示踪酶的ALP活性应在l 000U/mg以上。ALP常用的底物为对硝基苯磷酸盐(PNP),降解产物为黄色的对硝基酚。经NaOH终止酶反应后,颜色维持比较稳定。
在ELISA中酶作用于底物后生成有色物质、荧光物质或导致化学发光,分别可用分光光度计、荧光光度计测量及照度计测量。荧光和化学发光测定的敏感度均高于比色测定,标准曲线的线性范围亦较比色反应宽,测定效果优于常用的比色ELISA。
 
    4.固相载体  固相载体是ELISA中用以分离结合标记物和游离标记物的主要手段,应与各种免疫活性物质有良好的结合性能并且不改变其免疫活性。常用的固相载体有聚苯乙烯塑料和硝酸纤维素膜。
 
    5.包被  将免疫活性物质(抗原或抗体)结合于固相载体上的过程称为包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纤维薄膜等;常用的方法有吸附法、化学交联法及亲和素-生物素间接包被法,特别是后一方法,效率高,而且可用以包被不易吸附在固相上的各种免疫活性物质。具体做法是先将链霉亲和素包被在固相载体上,然后使与生物素化的抗原或抗体与之结合。由于亲和素与生物素之间的高亲和力,抗原或抗体即间接结合在亲和素包被的固相上。

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