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1．抗原 在ELISA中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有3类，即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。自然抗原的纯度不高，特异性不强；合成抗原一般为多肽片段，缺乏天然抗原所具有的立体结构表位，亲和力不高，可能导致相应表位的抗体漏检；基因重组抗原具有安全、特异性强、亲和力高、产量大等特点，是一种比较理想的抗原，但其纯化比较困难。 2．抗体 在ELISA中应用的抗体可分为多克隆抗体（多抗）和单克隆抗体（单抗）。多抗取白免疫动物的抗血清，制备较简单，但抗血清成分复杂，除含针对抗原（多个表位）的抗体外，还含有多种其他抗体，亲和力和特异性相对要低于单抗，且制备周期长，批间差异较大。而单抗仅针对抗体的单一表位，亲和力和特异性均较多抗高，且制备技术成熟，产量大，批间差异小，但结合位点的单一也正是其弱点之所在，在双抗体夹心法中，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，容易造成假阴．性结果。在使用双单抗一步法时，应注意抗原过剩时的“钩状效应"
3．酶和底物 在ELISA中最常用的酶为HRP和ALP。
（1）HRP：是一种糖蛋白，含糖量约18％，分子量为44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素） 结合形成一种卟啉蛋白质。主酶为五色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，是酶的活性基团，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用纯度值（reinhartzahl，RZ）表示，RZ＝A403nm／A275nm，即403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度HRP的RZ值应≥3．0。HRP质量的另一重要指标是酶活力，以单位（unit，U）表示。用于标记的HRP比活性应≥250U／mg。HRP的作用底物为H202，催化下列反应；
DH2+H202 HRP D+2H2O
上式中DH2为供氢体（即底物），H2O2为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇和尿素的过氧化物。HRP的底物有多种，在ELISA中常用的有：邻苯二胺（orthophenylenediamine，OPD），四甲基联苯胺（3，3，5，5- tetramethyl-benzidine，TMB）和2，2，-连氮基-双-3-乙基苯噻唑啉磺酸盐［2，2，-azino-bisc（3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6），ABTS］。三者各有优缺点：OPD是在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，但配成溶液后稳定性差，且有致异变性；TMB经酶作用后由五色变蓝色，加酸终止反应后显黄色，目测对比鲜明，可比色定量，溶液的稳定性也较差，但无致异变性，因此应用日见增多；ABTS虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。
（2）ALP：是一种磷酸酯的水解酶，用做示踪酶的ALP活性应在l 000U／mg以上。ALP常用的底物为对硝基苯磷酸盐（PNP），降解产物为黄色的对硝基酚。经NaOH终止酶反应后，颜色维持比较稳定。
在ELISA中酶作用于底物后生成有色物质、荧光物质或导致化学发光，分别可用分光光度计、荧光光度计测量及照度计测量。荧光和化学发光测定的敏感度均高于比色测定，标准曲线的线性范围亦较比色反应宽，测定效果优于常用的比色ELISA。
4．固相载体 固相载体是ELISA中用以分离结合标记物和游离标记物的主要手段，应与各种免疫活性物质有良好的结合性能并且不改变其免疫活性。常用的固相载体有聚苯乙烯塑料和硝酸纤维素膜。
5．包被 将免疫活性物质（抗原或抗体）结合于固相载体上的过程称为包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纤维薄膜等；常用的方法有吸附法、化学交联法及亲和素-生物素间接包被法，特别是后一方法，效率高，而且可用以包被不易吸附在固相上的各种免疫活性物质。具体做法是先将链霉亲和素包被在固相载体上，然后使与生物素化的抗原或抗体与之结合。由于亲和素与生物素之间的高亲和力，抗原或抗体即间接结合在亲和素包被的固相上。 |
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