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周爱华(云南省楚雄州人民医院药剂科，楚雄675000)

摘要：目的：〖HTK〗探讨影响鲎试验准确性的干扰因素和处理方法。方法：通过对干扰鲎试验准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、配制原料等)，提出了鲎试验中应注意的问题。结果：只要克服了检查中的干扰因素，鲎法具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。结论：凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰但可克服的注射剂药品，均可用鲎法代替家兔法检查其热原。

关键词：鲎试验；热原；家兔热原检查法；注意事项

中图分类号：R92712文献标识码：B文章编号：1006-0111(2000)03-0162-02

    鲎试验是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定的一种方法[1]。它具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够全部以鲎法代替家兔热原检查法。但是该法受到许多因素的影响，故在做鲎试验检查时，应注意下列问题。

1鲎试剂本身

1.1鲎试剂灵敏度为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。建议法定部门和生产单位应注意鲎试剂的质量检查。

1.2供试品稀释在取样品时，一定要熟悉中国药典的内容，不能直接取大输液原液0.1ml进行检查，这是排除干扰因素的简单有效的方法。因药典已明确规定试验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml，根据供试品的稀释公式：供试品稀释倍数=L/λυL：供试品的内毒素限量(1EU/ml)λυ：鲎试剂灵敏度的标示值(EU/ml)故检测大输液均应稀释后才能进行试验，如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。在4h内不得与鲎试剂产生凝集反应。

    如果直接用供试品原液试验，就会使供试品的内毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，鲎法检出的阳性率会提高，兔法复核的机遇也将增多，势必会浪费人力物力。

2操作条件

2.1操作熟练程度操作时严格按无菌操作法进行，安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内及有一个比较整齐的颈口。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确量取。操作时，双手避免在安瓿或试管的上方来回移动，加样后迅速封闭管口，并立即放入恒温水浴箱中，且整个操作过程中时间应紧凑，防止微生物的污染，否则易致假阳性的出现。

2.2混合液的pH值供试液与鲎试剂混合液的pH值对鲎试验的影响较大，根据国内外资料的报道，试验的最适pH为6.25～7.25才能形成最佳凝胶[2]。而药典规定各种葡萄糖注射液的pH为3.2～5.5，我院控制在3.7～42之间。我们曾对pH值小于4.0的多批次葡萄糖注射液作了调pH和不调pH的比较试验，结果发现在该pH范围内两者无显著差异，不调pH者阴性抑制试验仍可得到坚实的凝胶，说明不影响反应灵敏度，且鲎试剂本身具有一定的缓冲能力。但pH值过大或过小均可抑制鲎试剂与细菌内毒素的反应，其原因可能是pH值过大或过小均可破坏极微量的内毒素。

2.3保温温度将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37、40、43、46、49℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49℃保温90min也未出现凝胶。

    从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～40℃之间，随着温度的升高，鲎试剂的灵敏度亦增大，在40～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响，达到49℃或更高温度时，则会破坏鲎试剂。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37±1)℃之间，才可获得理想的结果。

2.4保温时间将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，37℃水浴保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶形成的坚实状态随着时间的延长而坚固。

    从上述实验可以看出，延长保温时间，可以提高鲎试剂的灵敏度，增加假阳性。故应遵守我国药典规定的保温(60±2)min时间。

2.5在鲎试验过程中应防止试管受到振动鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判为阴性。因此，在鲎试验过程中，不宜进行容易引起试管振动的实验操作，试验用的试管架的眼孔直径应与安瓿或试管直径相接近，避免安瓿或试管左右晃动。水浴箱要放置在固定不易受到振动的地方，保温过程中不可随时取出观察。

3其它

3.1配制的原料在鲎试验检测中，0.9%氯化钠注射液多次出现假阳性反应，对此进行了实验工作，查找原因，发现阳性率高与厂家原料有关。笔者把不同厂家生产的氯化钠原料配制的0.9%氯化钠注射液，对不能通过鲎法检查的送药检所用兔法检查，结果为阴性，其中个别厂家的阳性率高于其它厂家，为此将不同厂家的氯化的原料分别在230℃烘焙1h后进行比较，发现个别产品色泽明显变黄。按中国药典1995年版附录规定的易炭化物检查，分别将不同厂家的氯化钠原料进行易炭化物相对照检查，结果上述明显变黄厂家的氯化钠色泽较深。因此认为个别厂家的注射用氯化钠原料含有较多的有机杂质，希望厂家要控制好质量。另外，在葡萄糖原料中偶有存在着β-D聚葡糖的现象，它与鲎试剂发生凝集反应，但注入兔体内不能使其升温，故造成假阳性，所以最好是使用定点厂家合格的葡萄糖原料。

3.2所用器皿均应彻底洗净和灭菌安全实验用器皿均应充分洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物破坏极微量的内毒素。灭菌应按药典中的有关方法处理，防止引入外源性内毒素。如有条件的话可用合格的细菌内毒素快检盒。

3.3阳性对照我国药典规定鲎试验必须做阳性对照，其目的就是证实实验条件下鲎试剂的活性，所以在实验过程中，阳性对照如为阴性，此次试验无效，应重新复做。另外细菌内毒素工作标准品应现用现稀释，不可放置后再用。

参考文献：

［1］王茂林鲎试剂法检查热原的应用范围［J］中国医院药学杂志，1990，10(1)：41

［2］高国政，颜锦pH值影响细菌内毒素测定的实验室研究［J］中国药学杂志，1998，33(3)：162

收稿日期：1999-11-29
 

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