细菌内毒素检查法替代生物材料和医疗器械热原检查的近况
陈丹丹 黄清泉 王春仁 奚廷斐 来源：实验动物科学与管理 厦门鲎试剂厂录入
中国药品生物制品检定所 北京 100050
关键词:细菌内毒素；热原检查；生物材料；医疗器械
1 概述
生物材料和医疗器械是指用于诊断和治疗的介入和植入人体的材料和器械。生物材料和医疗器械是近30年来发展起来的新兴学科，目前己经在临床广泛应用。如何保证生物材料和医疗器械的安全性问题越来越受到各国政府和学术界的重视。在生物材料和医疗器械的安全性评价中，热原检查无疑是重要的内容之一。
1942年热原检查法首次收载于美国药典12版(USP XⅡ)。随后世界各国药典相继收载了这一方法，半个多世纪以来该方法一直作为法定的热原检查法为各国药典所采用。
各国药典收载的热原检查方法基木相同。该法是将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定的时间内，观察家兔体温升高的情况，以判断供试品中所含热原的限度是否符合规定的一种方法。直至目前，各国药典确认的热原检查法仍系沿用60年前建立起来的家兔升温试验。
由于家兔法本身存在的局限性，人们一直试图寻找一些新的方法替代或补充。因为家兔法虽然能直观地反映各种热原的致热程度，但不易标准化、不能定量、重现性差、灵敏度不如鲎试验高、受某些药品木身的药理活性及理化性质的影响较大、费用高、费时、结果与家兔的品系和饲养条件有关、涉及使用动物等。目前己经成熟的热原检查的替代方法是细菌内毒素检查法。
细菌内毒素检查法(Bacterial Endotoxins Test, BET)自1968年由美国学者Bang和Levin正式建立(该法又称作鲎试验，即Limulus Test)至今，经过二十多年的不断完善和发展，现巳在医药卫生、环境保护等方面发挥着极其重要的作用。
细菌内毒素检查法在药品检验中的应用是从放射性药品和注射用水开始的。1980年USP20版首次收载细菌内毒素检查法，1983年UPS20第四增补本规定5种水和40种放射性药品采用细菌内毒素检查法代替热原检查法。1991年，U SP22版第五增补木又规定185种药品采用细菌内毒素检查法代替热原检查法。1995年，UPS23规定471种药品进行细菌内毒素检查，保留热原检查的品种不足40种。美国药典24版共收载579种药品进行细菌内毒素检查。
对于那些直接或间接与心血管系统或软体组织接触的标有无热原字样的生物材料和医疗器械来说，进行热原检查是必须的。美国药典中收载的进行细菌内毒素检查的品种如下:液体给药设备，延伸设备，传输设备，血液给药设备，静脉内导管，植入的体外氧气导管和附件，透析器，透析管和附件，血管移植物，心瓣膜，肌肉内药物传送管和输液(血)器等。（厦门鲎试剂厂录入）
www.houshiji.com
2 现在已经采用细菌内毒素检查法替代热原检查法的品种
我们统计了我们工作中己经采用内毒素检查法的品种共有35种，具体如下，这是一个不完全的统计，因为还有其它我们没有涉及的品种。
它们是:眼科用粘弹剂、人工晶体、下腔静脉滤器、必施无菌灌注液、疝修补网织片、体内埋植泵、冠脉支架系统、一次性使用无菌穿刺针、胆道球囊导管、一次性血液管理套件、眼科用重水、硅油、肾动脉支架、膜式氧合器、一次性输液器、一次性注射器、JRS系列自弹式血管内支架及输送系统、JRZ系列不锈钢z型支架及输送系统、JRN系列镍钦形状记忆合金支架及输送系统、CLIN1 MACS管道系统、巴德LU MINEXX支架放置系统、眼内灌注用平衡盐溶液,CLINIMACS CD34细胞分选试剂、颈动脉转流管、静脉导管套件盒及附件、眼用透明质酸钠、海藻酸钠微球血管栓塞剂一次性使用麻醉穿刺包、张力环、青光眼引流器、输精管滤过装置、外科种植体、组织固定系统、血管移植物、生物陶瓷义眼台、器官保存液等。（厦门鲎试剂厂www.houshiji.com录入）
3 仍然采用热原检查法的品种（厦门鲎试剂厂www.houshiji.com录入）
根据我们工作中的品种进行统计，仍有18种采用热原检查法，即家兔法。它们是:止血胶原海绵、医用即溶止血纱布、一次性活检装置、一次性使用输血泵、心脏瓣膜、尼龙眼科带针缝合线、一次性使用中心静脉导管，PGA可吸收缝合线、人工骨粒、生物衍生骨、外科修补材料、水凝胶乳房植入体、一次性使用创伤手术缝合包、盐水乳房假体、硅凝胶乳房假体、可吸收椎间融合器、聚丙烯粒料、离心泵泵头等。（厦门鲎试剂厂www.houshiji.com录入）
4 采用细菌内毒素检查法替代家兔法的优缺点（厦门鲎试剂厂www.houshiji.com录入）
优点:方便、快捷、经济:缺点:干扰作用、回收率低。
5 应用
生物材料和医疗器械的热原检查用细菌内毒素检查法来替代是大势所趋，相信随着细菌内毒素检查法的广泛应用，越来越多品种的热原检查将会被鲎试验法所取代。同时这也是动物保护的一个重要内容。自1959年W. M. S.Russell(动物学家)和 R. L. Burch(微安全性家)发表《仁慈试验技术原理》(The Principles of Humane Experirrrental Technique) 一书以来，以减少(Reduction)、优化(Refinement) 和替代(Replacement)为核心的动物试验替代方法的3R理论己经被愈来愈多的的科学家所接受，并在实际研究工作中得到了广泛的应用，对推动生命科学以及相关学科研究的发展起到了重要作用。到目前为止，一个定期连续召开的世界性学术会议--动物试验替代方法世界大会己经召开了二次:1993年在美国的巴尔的摩( Baltimore) , 1996年在荷兰的乌特勒支(Utrecht) , 1999年在意大利的波伦那(Bologna) 。第四次于2002年8月在美国的新奥尔良(New Orleans)召开.
此外，除了用细菌内毒素试验替代热原试验外，目前很多学者正在研究用人的血液THP-1和MM6细胞系检测热原。（厦门鲎试剂厂www.houshiji.com录入）
目前存在的问题是标准、方法不规范和统一。（厦门鲎试剂厂www.houshiji.com录入）
发布时间：2008-12-30
医用输液、输血、注射器具检验方法 （内毒素部分）GBT14233.2-2005
GBT14233.2-2005-医用输液、输血、注射器具检验方法 第二部分：生物试验方法（内毒素部分）
GB/T 14233.2-2005
4 细菌内毒素试验
4.1 目的
本试验为《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定的“凝胶法”，系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判定供试品中内毒素的限量是否符合规定。
如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用本试验。
4.2 试剂
细菌内毒素国家标准品、细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水。
注：细菌内毒素检查用水系指符合《中国药典（二部）》附录中“细菌内毒素检查法”规定的灭菌注射用水。
4.3 主要设备
超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、电热干燥箱、旋涡混合器。
4.4 试验前准备
4.4.1 器具处理
试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素。玻璃器皿置电热干燥箱内180℃干烤至少2h，或250℃干烤至少30min，塑料器皿置30％双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后置60℃烘干备用。
4.4.2 鲎试剂灵敏度复核试验
4.4.2.1 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
4.4.2.2 试验步骤按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定进行。
见http://www.houshiji.com/newslist.asp?newsid=135
4.4.3 供试品干扰试验
4.4.3.1 对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，以检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何可能影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰试验。
4.4.3.2 每种医疗器械产品应取3批并分别使用不少于两个制造商生产的鲎试剂进行干扰试验。供试液制备按4.5.3规定进行。
4.4.3.3 试验步骤按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中“凝胶法”规定进行。
4.4.3.4 供试品对细菌内毒素试验有干扰作用，可选用下列适宜方法排除干扰：
a) 使用更灵敏的鲎试剂对供试液进行更大倍数稀释；
b) 采用无热原氨基甲烷缓冲液稀释供试液；
c) 采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液PH值在6.0~8.0范围内；
d) 采用阳离子缓冲液（MgSO4或MgCl2）稀释供试液以调节离子浓度。
4.5 试验方法
4.5.1 供试品数量
同一批号至少3个单位供试品。
4.5.2 浸提介质
细菌内毒素检查用水
4.5.3 供试液制备
根据产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质体积，选用下列适宜方法制备供试液：
a) 管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37±1）℃恒温箱中浸提不少于1h；
b) 小型配件或实体类器具置无热原玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振摇数次，在
（37±1）℃恒温箱中浸泡不少于1h。
供试液贮存应不超过2 h。
注1：浸提介质体积计算公式：V=L/λ
式中：
V——浸提介质体积，单位为毫升（mL）；
L——产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每件（EU/件）；
λ——所用鲎试剂灵敏度标示值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EU/mL）。
注2：输液、输血、注射器具细菌内毒素限值在产品标准中规定，宜尽可能低。推荐输液、输血、
注射器具细菌内毒素限量每件不超过20EU，与脑脊液接触和胸内应用医疗器械每件不超过2.15EU。
4．5．4 试验步骤和结果判定
按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中“凝胶法”规定进行。
4．5．5 试验报告
试验报告中宜给出下列信息：
a)供试品名称；
b)生产批号；
c)供试液制备方法；
d)细菌内毒素限量；
e)结果判定。
--------节选自 《GBT14233.2-2005-医用输液、输血、注射器具检验方法》
厦门鲎试剂厂www.houshiji.com 整理录入
2008年11月 |
