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鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。 鲎试验法是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，它简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，因而被欧美药典及我国药典定为法定内毒素检查法，并已被世界各国所采用。
目前国际上销售的鲎试剂有两种，一种称美洲鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate），缩写为LAL，由美国生产；另一种称东方鲎鲎试剂（Tachypleus Amebocyte Lysate），缩写为TAL。实验证明：美洲鲎试剂-LAL比东方鲎试剂LAL更纯洁，检测效果更好。
TAL检查内毒素有很多方法，目前应用最广泛的是凝胶法，此外还有动态浊度法﹑显色基质法,比色法等。其用途有以下几方面：1. 药检：用于注射药品﹑放射性药物﹑生物制品﹑注射器及生产工艺流程中的内毒素检测；2. 临床：用于检测病人各种体液中的内毒素含量；3. 其他：用于检测水或食品中的内毒素含量。
2005年版中国药典 《细菌内毒素检查法-鲎试剂法》(鲎试剂－LAL法)
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分钟，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0-8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的建立 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：
L=K/M
式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；
K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5E U/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h)。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U/ (kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：
MVD=CL/λ
式中L为供试品的细菌内毒素限值；
C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U /ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效浓度C=λ/L。
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。
鲎试剂灵敏度复核试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取含有分装了0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，及每一个浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).
λc=1g-1(∑X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。
Es= 1g-1(∑Xs/4)
Et= 1g-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。
当Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5 Es和2 Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
注：A 供试品溶液；B干扰试验系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D阴性对照。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
1）凝胶限量试验
按表2制备溶液A、B、C、D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2 凝胶限量试验溶液的制备
注：A供试品溶液；B供试品阳性对照；C阳性对照；D阴性对照。
结果判断 保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。
若溶液A的两个平行管都为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。
2）凝胶半定量试验
本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。依表3制备溶液A、B、C和D。按鲎度剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ-2λ之间，试验有效。
系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度（按公式CE=1g-1(∑X/2)）。如果试验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。
如试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于λ乘以该供试品的最低稀释倍数）。如果结果都为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。
表3 凝胶半定量试验溶液的制备
注：A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。用检查用水进行2倍系列稀释，从通过干扰试验的稀释倍数开始再稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，但随后的稀释也不得超过MVD；
B：含2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）；
C：含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ浓度标准内毒素的检查用水系列；
D：阴性对照。
方法2 光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反映混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度和透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。
光度测定试验应在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照在设定的时间内不发生反应，将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应该大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。
干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。每种溶液至少做2个平行管。
表4 光度测定法干扰试验的制备
注 A：稀释倍数未超过MVD的供试品溶液。
B：加入标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。
C：如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D：阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。
R=(CS-Ct)/λm×100%
当内毒素的回收率在50%~200%之间，则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围时，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并要重复干扰试验来验证处理的有效性。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
按“光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效：
（1）系列溶液C的结果要符合 “标准曲线的可靠性试验”中的要求。
（2）用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内。
（3）溶液D在规定的时间内不发生反应。
若供试品溶液所在平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。
（注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。）
美国药典USP24版细菌内毒素检查法(鲎试剂－LAL法)
本文是USP24细菌内毒素检查法（BACTERLAL ENDOTOXINS TEST）的译文，但目前执行的标准是USP24版第二增补本（USP—NF19 Second Supplement）的细菌内毒素检查法，读者可对照学习，从中可看出USP24细菌内毒素检查的不足之处。本文将介绍用鲎试剂检测样品内或样品上存在的细菌内毒素浓度的方法。鲎试剂（Limulus Amebocyte,LAL）来自鲎的循环细胞，经水提取而行，制备和检验后，用于凝固法。
反应的终点是将供检样品稀释后，与平行稀释的参考内毒素标准进行直接比较得到的。测得的内毒素含量用规定的内毒素单位表示。
鲎试剂也是用浊度法或显色法来读取数据的，这些试齐只要能满足这些选择方法的要求，就可以使用。在做试验时，需要先做出一条标准曲线，并用该曲线计算供检样品的内毒素含量，包括样品和对照液加鲎试剂后的培育时间和在分光光度计上读取光密度时使用的波长等操作，都应该事先规定好。如果是终点浊度法，则到达培育期后，应立刻读取读数。而动力学检测（凶手浊度法和显色法），光密度的测定是贯穿于整个反应期间，而用于计算结果的百分数就是从这些读数中计算出来的。在用终点法的显色法检测时，在到达事先规定的反应时间后，添加停止酶反应的试剂使反应停止后，再读取数据。
1、参考内毒素标准与对照内毒素标准
参考内毒素标准（Reference standard endotoxin,RSE）是美国药典（USP）的内毒素参考标准，其效价为每瓶10 000个USP内毒素单位（EU）。每瓶参考内毒素标准加5ml鲎试剂用水（LAL Reagent Watet），用旋转搅拌器间歇搅拌30min使其溶解，制成原液，用这一原液制作合适的系列稀释。原液应保存于冰箱中，用于以后的稀释，但保存时间不得超过14d。用前，用旋转搅拌器强力搅拌至少3min，每一步稀释，至少搅拌30s，然后才能用它稀释下一步。经稀释的参考内毒素不得贮存待以后使用，因为吸附作用会使其失去活性。对照内毒素标准（Contuol standard endotoxin,CSE）是以参考内毒素标准为标准另行制备的。一批新的对照内毒素标准在使用前应进行检定。检定时使用的鲎试剂应为试验中使用的同批鲎试剂。参考内毒素标准对照内毒素标准进行检定时，可使用鲎试剂的凝固法，按“试验操作”进行。每批对照内毒素标准，至少取1瓶与1瓶参考内毒素标准进行对比。参考内毒素标准的每个稀释度作4管。每瓶或每个样品的对照内毒素标准的每个稀释度也都要4管。参考内毒素标准终点的对数Log10的平均值和对照内毒素标准终点的对数Log10平均值之间的差值的反对数等于对照内毒素标准效价的标定值。可根据情况，将其变换成每ng干燥制剂的单位数或每瓶所含的单位数。
适宜的对照内毒素标准的效价应不小于2EU/ng也不大于50EU/ng。
2、试验的准备
鲎试剂的灵敏度应经过确证。试验中使用的所有容器和用具，都必须在≥250℃的烤箱中，用足够的时间进行加热处理、破坏这些用具表面上可能存在的外源性内毒素。
内毒素试验的结果是否可靠，还必须从试验使用的各种用具、溶液、洗涤用品中取样或提取样品，并用适当的方法证明它们对反应没有抑制或拉强或其它干扰作用。可按下述方法进行抑制试验或增强试验。试验中应设置阴性对照。如果鲎试剂的原材料、生产方法或处方发生改变时都要重新进行试验。
3、鲎试剂灵敏度的确认试验
为了确认鲎试剂标签上的灵敏度，每批至少取1瓶样品进行检定。参考内毒素标准（或对照内毒素标准）作2倍系列稀释，稀释成2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。其中λ是鲎试剂标签上的灵敏度EU/ml。
上述4个稀释度和阴性对照都要重复做4管。所得结果的几何平均值的对数应大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ。每一批新的鲎试剂，使用前都必须作标签灵敏度的确认试验。
4、抑制试验和增强试验
用不超过地大有效稀释而检测不出内毒素的样品，不加或内毒素，使最后浓度等于2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。按照试验操作（Test Procedure）项的规定用标准内毒素进行检定。不加和加内毒素的样品管至少做4管。同时，用水稀释上述相同浓度的内毒素和阴性对照各两管，做平行两管试验。按照计算和判定项的方法，计算样品终点内毒素浓度的几何平均值。
如果所得结果大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ,则该样品适合作细菌内毒素检查。
用中和、灭活或除去干扰物质方法或用不超过最大有效稀释度稀释检品后，可重做抑制试验和增强试验。如果用不超过最大有效稀释法，对已知加量的内毒素可以克服抑制和增强作用。则样品可以经过稀释后，再作内毒素检查。
如果在试验条件下，对未处理的样品检查出有内源性内毒素。则该样品不适合用于作抑制或拉强试验。不过，这种样品可用超过滤法将存在的内毒素去掉或做适当稀释、使之适合于作抑制或增强试验。稀释未处理样品（像开瓶溶解或在使用前注射前稀释那样），稀释到检验不到内毒素但不超过最大有效稀释倍数。再用这些已稀释的样品重作抑制试验或增强试验。
5、最大有效稀释度（MVD）
最大有效稀释度是指在使用时将药物溶解或稀释成恰好用于注射或其它非经口途径使用的浓度。有时为了避免给药量的体积（EU/ml）计算。用试剂标签上的灵敏度（EU/ml）λ除限定浓度，就可以得到MVD因子。如果某一试剂的限量浓度是按重量或按药品的活性单位计算（EU/mg或EU/单位）。用限量乘药品在溶液中的浓度，或按标签说明稀释成的浓度（mg/ml或单位/ml）,再除的λ，就可以得到MVD因子是准备试验而使试验有效的限定稀释因子。
6、试验操作
在准备和进行试验的过程中，必须十分注意，避免使样品受到大量的细菌污染。为了定量检测样品中的内毒素含量，常用系列稀释法稀释样品。用几何稀释法，使每上一步稀释较下一步稀释成为定比关系。试验中应设阴性、阳性对照和阳性产品对照。
供试的每一个样品的每一步系列稀释，至少要做重复性2管。标准内毒素的系列稀释应包括至少两个重复管。每一个框架的试管中都必须有一组标准内毒素的系列稀释管。只要每一个框架的环境条件是均一的，一个框架中可以由几个试管架组成。
（1）准备：标准内毒素以及鲎试剂的形状与装量，各个厂家不尽相同。因此，溶解和稀释必须按标签的说明进行。样品和鲎试剂混合物的pH，除另有规定外，必须位于6.0—8.0之间。样品的pH在试验前，可添加灭菌的无内毒素污染的氢氧化钠、盐酸或适宜的缓冲液调整。
（2）操作：取若干10mm×75mm试管或单个的试验管。每管加适量的阴性对照、标准内毒素、样品和阳性产品对照。阳性产品对照由鲎试剂、洗液或提取液添加2.0λ浓度的标准内毒素置中，准确记录试管的放置时间、于37℃±1℃，放置60min±2min,轻轻地取出观察。形成结实的凝胶，翻转180°，停留于原处不动者为阳性，记（+）号。不形成凝胶或形成的凝胶不结实，则判为阴性、记（-）号。拿取试管时，要轻拿轻放，避免不必要的碰撞，而出现假阴性结果。如果阳性产品对照呈阴性或内毒素标准的浓度不落在鲎试剂标签灵敏度2倍稀释的±1之间，或任何阴性对照出现阳性，试验应判为无效。然后计算样品中的内毒素含量。
7、计算和判定
（1）几何平均值的计算：系列稀释最后的阳性管为样品或样品加内毒素管的终点。记录每管的终点浓度E，换算成对数终点浓度e，用下列公式计算终点的几何平均浓度：
终点的几何平均浓度=log-1(Σe/f)
其中Σe为各稀释度对数终点之和；f为各稀释度的重复管安数。
（2）内毒素含量计算：计算被检样品中或被检样品上的内毒素含量（EU/ml，EU/g或EU/mg）时，首先计算出终点浓度E，再乘以稀释因子λ（λ为鲎试剂标签注明的灵敏度）。被检样品的几何平均浓度等于Σe/f的反对数，其中e等于终点浓度的对数，f为被检样品该稀释度的重复管数。
（3）结果判定：如果内毒素含量小于该品种规定的含量界限，则该品种符合规定。
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