【摘要】  目的：应用动态浊度法定量检测痰热清注射液中的细菌内毒素。方法：采用中国药典2005年版附录细菌内毒素定量检测法。结果: 将痰热清注射液进行1∶80稀释，可排除干扰，回收率在50％～200％，无干扰作用。结论：应用动态浊度法测定痰热清注射液中的细菌内毒素是可行的。

【关键词】  动态浊度法；痰热清注射液；细菌内毒素；干扰实验

痰热清注射液是由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花和连翘制成的中药复方注射剂,临床上用于风温肺热病属痰热阻肺证。本品的质量标准［1］中规定其致热物质检查为热原检查法，该法操作复杂、时间长、费用高。本文通过动态浊度法定量检测痰热清注射液中的细菌内毒素含量，建立痰热清注射液中细菌内毒素定量分析的方法。

　　1  材料与仪器

    动态浊度鲎试剂（批号：0411260，0409228，1.25 mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（批号：200610，160 Eu/支，中国药品生物制品检定所）；痰热清注射液（批号：050915、050926、051026、051125，10 mL/支，新谊医药集团·上海凯宝药业有限公司）；BET32B型细菌内毒素测定仪（天津大学无线电厂）；ZH2型漩涡混合器（天津药典仪器厂）。

　　2  方法与结果

　　2.1  细菌内毒素限值的确定［2］

    人体每小时可以接受的最大内毒素剂量为［5.0 EU/(kg·h) × 60 kg］=300 EU/h（人均体重按60 kg计算）；按痰热清注射液使用说明书，20 mL/次，加入5%葡萄糖注射液500 mL，控制滴数在60滴/min内（按每1 mL为20滴计算），另葡萄糖注射液的内毒素限量为0.5 EU/mL；故痰热清注射液允许带入的内毒素最大限量为［300×(500+20)×20/(60×60)-500×0.5］÷20＝30.8 EU/mL。本试验采用30.8 EU/mL作为细菌内毒素限值。

　　2.2  标准曲线的制作及可靠性［3］

    用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品进行溶解稀释，使其最终内毒素浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312 Eu/mL稀释系列。各取0.2 mL分别加到预先加有0.1 mL动态浊度鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET32B型细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做3支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC）。结果见表1。表1  标准曲线的可靠性试验（略）

    结果标准曲线为lgT=2.81660.3533lgC，r=0.9928，｜r｜>0.980,标准曲线最低内毒素浓度点λ1＝0.0312 Eu/mL，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，标准曲线成立。

　　2.3  干扰实验

　　2.3.1  供试品最大稀释倍数计算［3］ 

　　按公式MVD=L·C/λ，L为痰热清注射液细菌内毒素限值，C为100%，λ为标准曲线的最低内毒素浓度0.0312 Eu/mL，得最大稀释倍数（MVD）为987倍。

　　2.3.2  供试品溶液配制及预干扰实验［4］ 

　　将痰热清注射液（批号：050915）用细菌内毒素检查用水依次稀释为1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等比系列稀释液，作为供试品空白管（Ct），记为A液。同时另分别取内毒素标准溶液浓度为2 λm （λm为中点浓度0.125 Eu/mL）和供试品各等比系列的2倍浓度稀释液，在稀释用试管中等量混合，得到在此稀释倍数下含λm内毒素的供试品溶液，作为供试品阳性管（Cs），记为B液。分别取上述溶液各0.2 mL加入预先加有0.1 mL动态浊度法鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET32B型细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做2支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC）。计算回收率，回收率（％）=(Cs-Ct)/λm×100％，结果见表2。表2  预干扰实验结果（略）

    结果可见，阴性对照内毒素小于标准曲线最低内毒素浓度点λ1＝0.0312 Eu/mL，阴性合格。供试品等比稀释液中，1∶20稀释液的回收率为216.7%，说明该稀释液对鲎试剂有增强作用。1∶40、1∶80、1∶160稀释液的回收率均在50％～200%之间，符合中国药典规定。1∶80稀释液的回收率接近100％，最接近真实值，在日常检查中，选1∶80稀释液为宜。

　　2.3.3  干扰实验 

　　另取3批痰热清注射液，用细菌内毒素检查用水稀释为1∶80稀释液，作为供试品空白管，记为A液。同时分别取内毒素标准溶液浓度为2 λm和供试品1∶40稀释液，在稀释用试管中等量混合，得作为供试品阳性管，记为B液。分别取两批鲎试剂进行试验。分别取上述溶液各0.2mL加入预先加有0.1 mL动态浊度法鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET32B型细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做2支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC）。结果见表3。表3  干扰实验结果（略）

    结果可见，阴性对照内毒素小于标准曲线最低内毒素浓度点λ1＝0.0312 Eu/mL，阴性合格。供试品1∶80稀释液的回收率均在50％～200%之间，则该稀释液对鲎试剂反应无干扰作用。

　　2.4  定量检查

    根据以上干扰实验结果，对4批痰热清注射液以1∶80稀释液进行定量检查。结果见表4。表4  定量检查结果（略）

　　3  讨论

    痰热清注射液为中药制剂，其成分较复杂，故细菌内毒素限值应从严考虑。本法结合临床实际用药及考虑葡萄糖注射液的加和性，确保细菌内毒素限值安全、可靠。

    在实验中采取热原法和动态浊度法在相同实验条件下同时测定，两种实验方法得到一致的结果，符合中国药典对细菌内毒素实验成立的规定。动态浊度法定量进行细菌内毒素检测具有操作简便，结果准确，检测灵敏度高，减少人为误差，帮助分析干扰情况和可以观察反应过程等优点。

【参考文献】
  　　［1］国家食品药品监督管理局. 国家药品标准(试行)［S］.（YDZ00912003）.

　　［2］苑庆华, 芮 菁, 华晓东, 等. 动态浊度法定量检测替硝唑注射液中内毒素研究［J］. 中国药学杂志, 2003, 38(12): 952953.

　　［3］中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 2005年版. 北京: 化学工业出版社, 2005: 附录85.

　　［4］邱文炜, 詹云丽, 刘一波, 等. 动态浊度法定量测定鱼腥草注射液中内毒素含量［J］. 广东药学院学报, 2004, 20(6): 621622.

作者：林颖，陈华龙    作者单位：韶关学院医学院，广东韶关 512026
 

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