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【摘 要】 采用广州甘蔗糖业研究所和厦门大学共同研制的抗葡聚糖多克隆抗体和DEX-OVA交联的免疫原，确定了最佳的抗原包被浓度为5ug/ml，最佳的多抗工作浓度为1：8000。建立了竞争抑制ELISA定量检测葡聚糖的方法；并尝试了对原糖样本的检测。
【关键词】 葡聚糖；多克隆抗体；竞争抑制ELISA；定量检测；原糖
前言
从原理上说，葡聚糖的检测方法大体上可分为两大类：一类是基于葡聚糖发生化学变化的原理，即通过化学反应使葡聚糖变成可直接检测的其它物质进行测定，如Robert铜法是葡聚糖用硫酸水解后变成葡萄糖，再用酚显色，通过测定葡萄糖的量来推算葡聚糖的含量[1]；另一类是基于葡聚糖物理性质的原理，如Haze法、SPRI法，是利用葡聚糖会在酒精中沉淀，产生浊度，通过比较浊度的大小而判定葡聚糖的含量。但目前常用的葡聚糖定量检测方法都存在预处理困难、操作复杂、杂质干扰严重影响结果等缺陷[2]，免疫学检测法是一个很有希望的方向，具有快速、准确、样本预处理简单等优点，适合于制糖工艺任一工序中葡聚糖含量的测定。
本文采用广州甘蔗糖业研究所和厦门大学医学院共同研制的葡聚糖多克隆抗体[3]，初步建立了葡聚糖的竞争抑制ELISA检测方法。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及试验材料
BIO-RAD 680酶标仪；Dextran 40、2000为Pharmacia公司产品；抗葡聚糖阳性抗体为StemCell产品，其它试剂为国产试剂；葡聚糖多克隆抗体为广州甘蔗糖业研究所和厦门大学医学院共同研制。
1.2 葡聚糖竞争抑制ELISA方法的建立
1.2.1 方阵法确定抗原包被浓度和抗体的工作浓度[4]
将Dextran T40-OVA交联物按2.5、5、10、20μg/mL横向包被酶标板，每孔100μL（纯化的抗体经适当稀释后与梯度稀释的标准葡聚糖溶液各50μL），37℃，过夜。用封闭液（10%正常人血清）封闭2h；每孔加入不同稀释度的多抗100ul（1：1000……1：128000），同时设立阳性、阴性对照，37℃放置1h；用PBST洗涤液洗3次后,加羊抗兔酶标二抗，37℃放置1h；再用PBST洗3次，加入OPD底物溶液，37℃避光放置15min；加终止液（2M H2SO4溶液）终止反应。酶标仪读取OD490结果，根据OD490值及具体情况确定包被浓度和抗体的工作浓度。
1.2.2 葡聚糖竞争抑制ELISA方法的建立[5]
应用葡聚糖多克隆抗体，建立葡聚糖抑制竞争ELISA法。以Dextran 40-OVA交联物最佳包被浓度5ug/ml包被96孔板，设阳性、阴性对照。抗体为确立的最佳稀释度（1：8000），标准竞争抑制物为梯度稀释的葡聚糖，进行板内竞争反应1h，其他步骤同上述间接ELISA方法[3]。根据酶标仪读取OD490的数值，计算抑制率，以抑制率（A标/A0×%）为纵坐标，以抑制浓度为横坐标，绘制葡聚糖标准曲线。
1.2.3 葡聚糖竞争抑制ELISA方法[6]检测原糖样本
以Dextran 40-OVA交联物最佳包被浓度5ug/ml包被96孔板，设阳性、阴性对照。抗体为确立的最佳稀释度（1：8000），为消除蔗糖在过程中的影响，用与原糖浓度相同的蔗糖溶液和梯度稀释的葡聚糖混合液作为标准竞争抑制物，进行板内竞争反应1h，其他步骤同上述间接ELISA方法。根据酶标仪读取OD490的数值，计算抑制率，作出标准曲线。
同时以Dextran 40-OVA交联物最佳包被浓度5ug/ml包被96孔板，设阳性、阴性对照。抗体为确立的最佳稀释度（1：8000），用原糖样本作为竞争抑制物，进行板内竞争反应1h，其他步骤同上述间接ELISA方法。根据酶标仪读取OD490的数值，计算抑制率，和标准曲线中的抑制率比较，可得到原糖中葡聚糖的含量值。
2 结果与分析
2.1 最佳包被浓度与抗体稀释度的确立
ELISA实验结果见表1。根据表中的试验数据，在其它因素相同的情况下，在包被浓度5ug/ml，稀释度为1：8000时，OD490值为1.365。
表1 Dextran 40-OVA包被浓度与抗体稀释度的筛选
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Dextran 40-OVA (ug/ml)
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多抗稀释度
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1/1000
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1/2000
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1/4000
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1/8000
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1/16000
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1/32000
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1/64000
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1/128000
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2.5
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1.329
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0.935
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0.441
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0.204
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0.145
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0.082
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0.062
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0.038
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5
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2.922
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2.53
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2.019
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1.365
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0.908
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0.617
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0.368
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0.195
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10
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1.74
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1.506
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0.651
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0.26
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0.16
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0.098
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0.071
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0.047
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20
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1.767
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1.274
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0.563
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0.223
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0.105
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0.08
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0.053
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0.019
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0
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0.007
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0.005
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0.005
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0.006
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0.007
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0.007
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0.006
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0.006
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根据OD值应在1.0～1.5之间，且包被抗原及单抗用量少的原则，我们选择包被浓度为5ug/ml，抗体的稀释度为1：8000。
2.2 葡聚糖竞争ELISA标准曲线的建立
标准葡聚糖抑制浓度按1024ug/ml倍比稀释，用已经建立的ELISA方法做间接竞争抑制ELISA检测，实验结果表明，当葡聚糖浓度大于512ug/ml时，反应完全被抑制；当葡聚糖浓度小于0.06ug/ml时，反应几乎不被抑制。
以葡聚糖标准品浓度为横坐标，以抑制率（A标/A0×100）为纵坐标绘制标准曲线，取线性关系良好的范围作曲线，见图1。数据用EXCEL分析，曲线拟合方程为y=-5.9409x+94.618，相关系数R2=0.9951。
图1 ELISA标准曲线
2.3 原糖样本中葡聚糖含量的检测
2.3.1 检测原糖标准曲线
为消除蔗糖对测定结果的影响，标准竞争抑制物为蔗糖和葡聚糖混合液，其中蔗糖浓度为100mg/mL保持不变，葡聚糖标准品浓度1mg/mL起倍比稀释，结果见图2。
图2 检测原糖标准曲线
2.3.2 原糖样本检测
原糖样本浓度为100mg/mL，抑制率为26.29%，从图中可知此时葡聚糖浓度约为40。即原糖中葡聚糖含量为400×10-6。
3 讨论
本研究采用广州甘蔗糖业研究所和厦门大学共同研制的抗葡聚糖多克隆抗体和DEX-OVA交联的免疫原，确定了最佳的抗原包被浓度为5ug/ml，最佳的多抗工作浓度为1：8000。
以纯化的抗葡聚糖多克隆抗体为检测抗体，建立了竞争抑制ELISA定量检测葡聚糖的方法；从试验结果说明此方法葡聚糖的检出限为0.06×10-6至512×10-6。
该抗葡聚糖多克隆抗体具有特异性强，效价高的特点，建立的竞争抑制ELISA定量检测葡聚糖的方法具有简便、灵敏、准确等优点。
尝试了对原糖样本的实际检测，该原糖样本用《原糖》国标的酒精沉淀法测定，结果葡聚糖含量为483×10-6。由于酒精沉淀法测定的是总多糖的量，结果可能偏高，免疫法测定的结果比国标法测定结果稍低，是可以接受的。
参考文献
[1]陈其斌,周重吉.甘蔗制糖手册（第十二版）[M].华南理工大学出版社,1993.
[2]Christine F. Brown，Peter A.Inkerman. Specific Method for Quantitative Measurement of the Total Dextran Content of Raw Sugar,J.Agric.Food Chem.1992,40,227-233.
[3]曾练强,王生育,李雨虹等.葡聚糖多克隆抗体制备与纯化[M].广西轻工业,2009,(11）:4-5.
[4]JEROEN DOUWES, GERT DOEKES,ROY MONTIJN，et al. Measurement of b(133)-Glucans in Occupational and Home Environments with an Inhibition Enzyme Immunoassay，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Sept.1996,p.3176–3182.
[5]闻平,郭月芳.(1，3)一D一葡聚糖ELISA检测方法建立及初步临床应用[M].现代检验医学杂志,2003,l8(5):1-2.
[6]陈兰明,陈永董.黄曲霉毒素B1直接竞争抑制ELISA快速筛选法的建立[J].南京农业大学学报,1998.21(4):62-65.
[作者简介]曾练强，男，高级工程师，从事化学、微生物学等方面的研究工作。
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