0 引言
我国是世界第二大农药生产国，同时也是第一大农药消费国。随着各种农药在农业生产及日常生活的广泛应用，有关农药残留引起环境污染的事件日益增多，因此农药污染问题成为急需监测、治理的焦点之一。既往农药的检测多采用气相色谱法、液相色谱法等，这些方法需要昂贵的仪器设备、训练有素的专业技术人员，消耗试剂多，检测成本高，而且检测时间长，不利于现场监测 [1-3]。农药的免疫检测技术因具有快速、灵敏、特异性高等优点而引起相关研究人员和科研机构的重视，成为农药检测中一种简便、样品通量大、检测费用低廉、适用现场监测的分析方法 [4, 5]。毒死蜱(chlorpyrifos)，化学名称为O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯，作为我国“十一五”期间国家推广使用的农药之一，它是一种高效、广谱、中等毒性的有机磷类杀虫剂，具有触杀、胃毒和熏蒸三种作用方式，是防治粮食、蔬菜和其他经济作物的理想杀虫剂，但它同时也对农田环境及其有益生物产生了影响[6]，新近的流行病学调查发现毒死蜱与肺癌的发生可能存在某些联系，而且有研究显示其极可能具有内分泌干扰作用[7]。随着国内甲胺磷、久效磷、甲基对硫磷、对硫磷等高毒有机磷农药的禁用，毒死蜱逐渐代替高毒农药，应用范围越来越广[8]，其污染检测问题也随之而来。制备毒死蜱单克隆抗体，建立毒死蜱的免疫检测方法，可以有效地对毒死蜱残留进行监控分析，减少毒死蜱中毒事件的发生。本研究合成毒死蜱人工抗原，制备毒死蜱单克隆抗体，初步建立了毒死蜱间接ELISA 检测方法。
1 材料
1.1 试验动物与细胞
BALB/C 小鼠，6-8 周龄，雌性（购自扬州大学实验动物中心）；小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0（东南大学遗传学研究中心提供）。
1.2 主要试剂
弗氏完全佐剂(Sigma 公司)、弗氏不完全佐剂(Sigma 公司)、辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG(HRP-IgG，南京生兴生物技术公司)、RPMI-1640 基础培养基(Gibco 公司)、小牛血清(fetalcalf serum，FCS，杭州四季青公司)、20%小牛血清RPMI-1640 培养基、氨基喋呤(A)贮存液、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液、HAT 培养基、HT 培养基、青、链霉素溶液、50％聚乙二醇(PEG)溶液、PBS 缓冲液、包被液、洗涤液及稀释液(PBS-T 溶液，pH7.4)、封闭液、底物溶液(TMB)、毒死蜱样品溶液、正辛酸(分析纯，上海化学试剂公司)、25-28%浓氨水(分析纯，上海化学试剂公司)、杀螟硫磷、对硫磷、马拉硫磷标准品(江苏省疾病预防控制中心惠赠)、60mmoL/L 乙酸缓冲液、20mmoL/LPBS 缓冲液、饱和硫酸铵溶液、毒死蜱溶液。
1.3 主要仪器
Ultraspec-4000 型紫外/可见分光光度仪(Pharmacia Biotech 公司)、HJ-3 型电磁搅拌器(常州国华电器有限公司)、低温离心机(HITACHISCR20BC)、DOA-P181-BN 型抽气泵(GelmanLaboratory)、SK-1 型快速混匀器(常州国华电器有限公司)、TGL-16 型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)、LD5-2A 型低速离心机(北京医用离心机厂)、SW-CJ-2F 型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、IX51 型倒置显微镜(Olympus 公司)、5400 型CO2 培养箱(NAPCO公司)。
2 方法
2.1 毒死蜱完全抗原的合成与鉴定
2.1.1 半抗原合成
称取 1.06 克3-巯基丙酸(10mmol)于三口平底烧瓶，用50ml 无水乙醇溶解，加入NaOH1.0143 克，在磁力搅拌器上加热搅拌反应，直至溶解[9]。再加入溶于50ml 无水乙醇的毒死蜱原药3.51 克(10mmol)，60℃下回流反应2h，过滤反应混合物，减压浓缩。然后用5%NaHCO3 溶液50ml 将残留物转移到分液漏斗中，正已烷(50ml×2)萃取2 次，弃去有机相。
然后用浓盐酸调水相pH 至3 左右，二氯甲烷(50ml×3)萃取3 次，有机相过无水Na2SO4，减压浓缩近干，得棕红色油状物，柱层析过硅胶柱，收集洗脱液(正己烷/乙酸乙酯,1：2)的流动相，减压浓缩近干。加入少量无水乙醇溶解产物，重结晶后得到浅黄色晶体。合成路线见。
2.1.2 人工抗原的合成
将 0.0843 克(半抗原200μmol)溶于2mlN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入等当量的二环已基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下磁力搅拌反应过夜，离心收集上清液后，取500μl上清液加入6ml0.2M 硼酸盐缓冲液(pH9.0)溶解的10mg/mlBSA 溶液中，常温磁力搅拌下反应4h；另取500μl 上清液加入到7ml0.2M 硼酸盐缓冲液(pH9.0)溶解的15mg/mlOVA 溶液中，常温磁力搅拌下反应2h[6, 9]。前者合成物为免疫抗原，后者为包被抗原。
2.1.3 纯化与鉴定合成抗原
凝胶过滤层析法纯化免疫抗原和包被抗原，冷冻干燥，-20℃保存。紫外吸收光谱法鉴定合成抗原，钼兰比色法测定毒死蜱人工抗原结合比。
2.2 毒死蜱单克隆抗体的制备
2.2.1 小鼠免疫
将免疫抗原用PBS 缓冲液配制成1μg/μL 的溶液备用。取健康6-8 周龄雌性BALB/C 小鼠6 只，编号后按常规免疫方案分批免疫。第一次免疫，将免疫抗原PBS 溶液与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，抽取混匀的乳液进行腹腔多点注射，每只鼠的注射量为200μL；两周后进行第二次免疫，注射方法、注射体积不变，但改用弗氏不完全佐剂；以后按照第二次免疫方案以一周为间隔进行免疫；第三次免疫一周后，从小鼠尾部取少量血，通过间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价；待效价至少达到1∶1000 后，于融合前三天取同量免疫抗原不加佐剂对小鼠进行尾静脉注射以强化免疫[10, 11]。
2.2.2 细胞融合
细胞融合当天从小鼠尾静脉采血测定抗血清效价，选择血清抗体呈阳性且效价较高者用于细胞融合。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇（PEG）作用下进行融合。融合方案为约1min 加完50%PEG，前30 秒逐滴加入，后30 秒可稍快，吹打1min，静置1.5min，然后逐滴加入RPMI-1640 培养基，约6min 完成，再缓慢加入10mLRPMI-1640培养基以终止PEG 作用，750g 离心5min，弃上清夜，将细胞轻轻悬于20mLRPMI-1640 培养基中，置于CO2 培养箱待用。用RPMI-1640 培养基将饲养细胞配成2×105 个/mL 的悬浮液，将饲养细胞与融合细胞1∶1 混合，并转入培养瓶中培养12-24h。最后750g 离心5min收集细胞，用50mLHAT 培养基悬浮细胞，分装96 孔细胞培养板，每孔加入0.2mL，置于37℃、5%CO2 饱和湿度的培养箱中培养。
2.2.3 阳性杂交瘤细胞筛选及克隆化
融合后每 3-4 天半量换液一次。2-3 天，骨髓瘤细胞明显退化，5-7 后天待骨髓瘤细胞全部死亡，用HT 培养基取代HAT 培养基，每3-4 天半量换液一次。约6-7 天出现杂交瘤细胞克隆，细胞大、圆且透亮，在培养板的盖板上画上克隆生长的标记，记录有杂交瘤细胞生长的孔数。采用间接ELISA 与竞争ELISA 联合应用的方法对杂交瘤进行筛选，先用间接ELISA对所有杂交瘤生长孔的抗体进行初筛，再对阳性孔用竞争ELISA 进行抑制实验，对特异性抗体阳性孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆和亚克隆，直至单克隆的杂交瘤克隆化后上清的阳性率是100%，以获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株。扩大培养筛选出的单克隆杂交瘤细胞株，使用BALB/C 小鼠体内诱生腹水的方法大量制备单克隆抗体。采用正辛酸-硫酸铵沉淀法(CAASP)纯化抗体，从纯化后得到的单克隆抗体溶液中吸取80μL，用PBS 缓冲液稀释至2mL，随后用紫外分光光度计分别测定稀释液在260nm 及280nm 处的吸光度，计算抗体含量。
2.3 间接竞争ELISA 方法的建立
2.3.1 抗原抗体浓度的选择
通过方阵法确定抗原抗体工作浓度，分别用0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL 浓度的包被抗原分组包被酶标板，每孔100μL，4℃冰箱包被过夜。封闭后，将纯化后的单克隆抗体用PBS-T 液分别稀释至0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL，每孔50μL 分组对应加入封闭后的酶标板，随后每孔加入50μLPBS-T液，37℃温箱中温育1h。另设两孔阴性血清(1∶100 倍稀释)和空白对照(PBS-T)。甩干酶标板，洗涤液PBS-T 洗涤3 次，每次5min， 吸水纸拍干。加入PBS-T 溶液1∶5000 倍稀释的辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃温箱中孵育1h。洗板后，每孔加入临用前鲜配的底物(TMB)溶液100μL，避光置37℃温箱15min，每孔加50μL2mol/L 的H2SO4终止反应。酶标仪上测定450nm 波长处的各孔吸光值。
2.3.2 标准曲线的建立
用选定的工作浓度的包被抗原包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。待封闭酶标板后每孔加入50μL 抗体稀释液，随后分组加入50μL 一系列梯度浓度的毒死蜱溶液(10-3~102μg/mL)及作为对照的PBS-T 溶液，每一浓度的毒死蜱溶液设三个平行，37℃温箱中温育1h，间接竞争ELISA 试验毒死蜱对单克隆抗体的抑制标准曲线。酶标仪测定结果吸光度后，以毒死蜱浓度为横坐标(以对数刻度形式表示)，抑制率为纵坐标作标准抑制曲线，求出毒死蜱对单克隆抗体的抑制回归方程和半数抑制浓度IC50 值(即当抑制率为50%时的毒死蜱浓度)。其中：抑制率=（上述加不同毒死蜱浓度孔的吸光度值的3 孔平均值）/（对照孔的吸光度值的3 孔平均值）×100%。
2.3.3 单克隆抗体特性鉴定
取克隆化后的细胞株培养上清检测，分别用0.5μg 的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3包被酶标板，间接ELISA 鉴定单克隆抗体亚类。
2.3.4 交叉反应
性按照毒死蜱间接竞争ELISA 试验检测条件分别对杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷等与毒死蜱结构相似的有机磷类农药进行交叉反应实验。将上述农药按一定浓度梯度稀释,建立它们的抑制标准曲线，并计算各自的IC50，按下述公式计算交叉反应率：交叉反应率=(毒死蜱对单克隆抗体的IC50/其它试验农药的IC50)×100%
3 结果
3.1 毒死蜱完全抗原鉴定
紫外扫描光谱结果（200～360nm）见表1，合成的免疫抗原和包被抗原与载体蛋白BSA、OVA 相比，最大吸收波长发生发生明显的变化，向远紫外区偏移；免疫抗原和包被抗原与毒死蜱半抗原最大吸收波长也不一致，这表明合成抗原与载体蛋白及毒死蜱半抗原不是同一种物质，间接说明人工抗原的合成是成功的。
3.2 毒死蜱半抗原与载体蛋白结合比的测定
以系列浓度的磷标准液的吸光度值为纵坐标，磷浓度为横坐标，做出标准曲线，得到吸光度值对磷浓度的回归方程y=0.4525x-0.0085。随后根据回归方程求出完全抗原溶液的磷浓度，按式计算合成抗原中磷含量及偶联结合比。免疫抗原和包被抗原中载体蛋白与毒死蜱偶联结合比分别为1：64 和1：19。
3.3 毒死蜱单克隆抗体的制备
免疫抗原免疫 BALB/C 小鼠，小鼠的血清效价以间接ELISA 法检测到阳性结果的最大稀释倍数表示，结果显示效价最高者可达1∶20000。选择血清效价高者用于细胞融合以制备单克隆抗体。
细胞融合5~7 天左右，倒置显微镜下可见大量未融合的细胞明显退化、缩小，逐渐死亡，并可见有小的杂交瘤细胞克隆出现，杂交瘤细胞大、圆且透亮，以后克隆逐渐长大，约两周后可长至培养孔底1/5 以上。融合细胞一共接种151 孔，其中44 孔有杂交瘤细胞生长，融合率为29.13%。间接ELISA 检测，阳性细胞孔5 孔，阳性率为3.31%，阳性孔与阴性血清孔的吸光度值之比最高达到12。
对筛选出的5 孔阳性孔细胞进行竞争抑制实验，挑选出其中阳性吸光度值较高、抑制效果较明显的细胞进行有限稀释法克隆或亚克隆，最终得到2 株能稳定分泌毒死蜱抗体的单克隆杂交瘤细胞株。采用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，得到的单克隆抗体溶液稀释后，使用紫外分光光度法测定抗体浓度为4.08mg/mL。间接ELISA 表明，2 株细胞分泌的抗毒死蜱单克隆抗体均为IgG1 型蛋白。
3.4 间接ELISA 试验最适工作浓度
用方阵试验对间接竞争ELISA 法的抗原、抗体的工作浓度进行筛选和确定，结果见表2。挑选能使吸光度值在1.0 左右而本身值均较小的抗原和抗体的浓度作为间接ELISA 试验的工作浓度。由表4 选择间接竞争ELISA 试验的最适工作浓度是：包被抗原为1μg/ml，抗体为0.4μg/ml。
3.5 毒死蜱对纯化后抗体的抑制曲线和检测灵敏度
以系列浓度的毒死蜱溶液做间接竞争ELISA 试验，根据抑制率与毒死蜱浓度之间的关系作图，得标准曲线。根据回归方程y=-0.2669Ln(x)-0.0347，(R2=0.9859)，得出其半数抑制浓度IC50 为0.135μg/mL，线性检测范围为0.04～0.42μg/mL，最低检测限为0.03μg/mL。
3.6 单克隆抗体特异性研究
分别对毒死蜱及杀螟硫磷、对硫磷、马拉硫磷做间接竞争ELISA 试验，结果见表3，这三种农药与毒死蜱的交叉反应率分别小于0.09%、0.14%、0.05%。
4 讨论
毒死蜱属于小分子物质，其自身不具备免疫原性，必须先与免疫原性较强的大分子物质相偶联，制备人工抗原，才能刺激机体产生抗体。人工抗原的合成是农药残留免疫分析中制备抗体和建立免疫分析方法的关键步骤，而半抗原的合成则是人工抗原合成的前提。农药分子半抗原设计时应使半抗原最大限度的保留农药分子的特征化学结构，以便农药分子能被免疫活性细胞所识别，制备出特异性强，亲和力高的抗体。本研究选择在苯环上引入活性基团羧基，采用碳二亚胺法合成毒死蜱免疫抗原和包被抗原，经紫外光谱扫描鉴定后，间接证明成功合成人工抗原。合成的毒死蜱免疫抗原与包被抗原中载体蛋白与毒死蜱的结合比分别为1∶64 与1∶19，与相关文献相比结合比稍偏大。但是人工抗原的结合比大小没有绝对的标准，各报道也不一致[13]，人工抗原的结合比稍大，将有更多的半抗原分子可以暴露在外面，理论上将增加机体产生抗毒死蜱抗体的能力。
在农产品及环境农药残留分析中，单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，只与同一抗原决定簇反应，不易产生交叉反应；②可重复性，由于来自统一细胞，能够提供完全一样的抗体制剂，易于标准化管理；③一经制出，可无限量地供应，适宜规模化生产；④生产单克隆抗体，可以用不纯的抗原作为免疫原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。由于McAb 具有特异、灵敏、快速、简便、痕量检测以及可大批量样本检测的优点，日益显示出强大的应用价值和前景。基于单克隆抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种免疫测定技术，它是一种在固相载体上进行的免疫酶反应，其检测核心是利用抗原抗体之间的特异性吸附，在固相载体上层层叠加，可以是2 层、3 层甚至更多层，而只进行一次酶促反应使底物显色，从而对待测物进行定量或定性分析。它可特异、快速、简便地检测农药残留，尤其适用于现场控制农药、蔬菜、水果中的农药残留，对发展无污染农产品，保障人体健康发挥着重要作用。本研究初步建立了检测毒死蜱的间接竞争ELISA 方法，半数抑制浓度IC50 为0.135μg/mL，线性检测范围为0.04～0.42μg/mL，最低检测限为0.03μg/mL，低于常规气相色谱法对毒死蜱的仪器检出限0.05mg/L。特异性研究结果表明制备的单克隆抗体与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷三种与毒死蜱结构相似的有机磷类农药几乎没有交叉反应，该单克隆抗体特异性较好。
本研究初步建立的间接ELISA 法检测毒死蜱的半数抑制浓度IC50，与其他研究者[6, 12]
制备的毒死蜱多克隆抗体相比，灵敏度相当；与国外的毒死蜱单克隆抗体相关研究结果比较[11, 12]，本研究ELISA 试验的灵敏度相对偏低，两者相差了1 个数量级，与国内相比[14]，灵敏度相当。分析灵敏度与国外研究结果相比偏低的原因可能由于ELISA 反应体系中影响因素较多：包被抗原及抗体的浓度，酶标二抗的稀释倍数，反应的温育时间，洗涤次数，缓冲液的pH 值，封闭液的选择等都会对试验的结果有影响，而本研究仅对不同的包被抗原和抗体浓度方面进行了研究筛选，因此可能尚没有摸索出该抗体ELISA 的最佳反应条件，如果继续就以上因素进一步优化，试验灵敏度会有所提高。而且本次试验中所用毒死蜱标准溶液是以毒死蜱原药配制的，纯度只有98.8%，如果换用高纯度的毒死蜱标准品配制，也会提高试验灵敏度。此外因为小鼠腹水含有杂蛋白，只采用正辛酸-硫酸铵沉淀一步纯化法，不可能得到高纯度的抗体，将此纯化后的抗体再过一次DEAE 离子交换层析柱或羟基磷灰石柱，或者直接进行免疫亲合层析纯化将会得到更纯的抗体，这也将有助于提高ELISA 试验的灵敏度。因此，本研究应进一步提高该方法的灵敏度，并对准确度、精密度和重复性做深入的研究分析，为开发检测毒死蜱的酶联免疫检测试剂盒奠定基础。
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[参考文献] (References)
[1] 宋欢, 薛园园, 林勤保. 色谱法分析氨基甲酸酯类农药残留的研究进展[J]. 化学分析计量, 2009, 18(3):86-88
[2] 赵辉. 番茄和苹果中14 种有机氯和拟除虫菊酯类农药残留量的毛细管气相色谱检测[J]. 农业环境科学学报, 2007, 26(2): 734-738
[3] 孙军, 潘玉香. 气相色谱双塔双柱同时测定蔬菜中多种有机氯及拟除虫菊酯类农药残留量[J]. 分析试验室, 2007, 26(8): 56-60
[4] 刘俊花. 有机磷农药免疫检测方法研究进展[J]. 农产品加工, 2009, 182(8): 57-58
[5] 高俊娥, 李盾, 刘铭钧. 农药残留快速检测技术的研究进展[J].农药, 2007, 46(6): 361-364
[6] 吴刚, 黄雅丽, 朱国念, 等 有机磷杀虫剂毒死蜱的免疫化学分析方法研究[J]. 中国农业科学, 2004,37(3):382-386
[7] 王金花, 陆贻通. 农药毒死蜱的生态风险及其微生物修复技术研究进展[J]. 环境污染与防治, 2006, 28(2):125-127
[8] 姜书凯. 毒死蜱产业发展现状和前景[J]. 农药研究与应用, 2008, 12(3): 1-3
[9]朱国念, 吴刚, 吴慧明. 有机磷杀虫剂毒死蜱人工抗原的合成与鉴定[J]. 中国农业科学, 2003, 36（6）：657 - 662
[10] Manclus J J, Primo J, Montoya A. Development of enzyme-linked immunosorbent assays for the insecticideChlorpyrifos. 1. monoclonal antibody production and immunoassay design[J]. Journal of Agricultural and FoodChemistry, 1996 ,44: 4052- 4062
[11] Manclus J J, Primo J, Montoya A. Development of enzymelinked immunosorbent assays for the insecticideChlorpyrifos.2.Assay optimization and application to environmental waters[J]. Journal of Agricultural & FoodChemistry, 1996,44：4063-4070.
[12] 韩丽君, 钱传范, 李文明, 等. 酶联免疫吸附分析法测定土壤中的毒死蜱[J]. 河南农业科学, 2005, 8:53-55
[13] Chen PS, Tonbara TY, Wamer H. Microdetermination of phosphorus. Anal. Chem. 1956, 28(11): 1756-1758
[14] 吴雅欣, 许园园, 潘家荣. 毒死蜱单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 核农学报, 2009, 23(2): 341-344
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