牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)在分类学上属黄病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒属(Pestivirus)成员，与属内的猪瘟病毒(classi—calswinefever virus，CSFV)及羊边界病毒(borderdiseasevirus，BDV)在血清学上有交叉反应。BVDV感染的牛能引起多种临床症状，如高热、腹泻、流涎、停食、白细胞减少、免疫抑制、黏膜充血等，还能引起奶牛产奶量下降，孕牛流产、产死胎及牛的持续性感染。野生反刍动物对BVDV非常敏感，尤其是鹿科动物更易感，在南达科他东南部的两头白尾鹿体内检测到了BVDV，并且在幼鹿中可持续感染。E2囊膜糖蛋白是BVDV抗原性的主要决定部分，同时又是变异率较高的一种结构蛋白，其变异可引起BVDV中和逃逸，导致动物持续感染。BVDV的检测方法也很多，Semrau等用荧光定量PCR对大量的样品进行了检测，结果发现从血清样品中检测到BVDV呈阳性的样品数量比口、鼻分泌物样品多。酶联免疫试验(ELISA)具有敏感、准确、快速、简单等优点，结合单抗应用具有很大的优势，抗BVDV单克隆抗体在牛病毒性腹泻病临床诊断，特别在研究BVDV抗原基因变异方面起着重要作用。我们在研究中用BVDVE2表达蛋白免疫Balb／c小鼠，研制出5株单抗，并在此基础上开展了抗原捕获ELISA(AC-ELISA)的研究工作。

1  材料与方法

1．1  病毒、单抗和阴性腹水

    sf9昆虫细胞表达的BVDVE2蛋白来自军事兽医研究所病毒室，抗BVDV E2蛋白单克隆抗体4G3(ELISA效价1．8X10 5)自制。阴性腹水自制。

1．2  试验动物

    1．5—2．0 kg的健康雌性家兔购自卫生部长春生物制品所，用于制备多抗。新生小牛购自长春市郊奶牛场，试验前检测BVDV为阴性，用于制备阴性小牛血清。

1．3  主要试剂

    蛋白A凝胶(ProteinA Sepharose)及抗体纯化层析柱购自BIOTECH公司，HRP标记的羊抗兔IgG、邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等均购自SIGMA公司。细胞培养基Grace为GIBCOBRL公司的产品；PAGE低分子量蛋白Marker购自TAKARA公司；PEG600购自上海生物工程有限公司；BCA试剂盒购自Pierce公司。

1．4  单抗纯化鉴定

    将IgM亚型的单抗4G3采用PEG6000纯化，纯化后的单抗用SDS-PAGE鉴定纯度和BCA试剂盒测定浓度后低温保存备用。

1．5  多抗的制备、纯化和浓度测定

    以弗氏完全佐剂(FCA)乳化杆状病毒表达并纯化的BVDVE2蛋白免疫家兔，分点皮下注射1 000μg／只，共免疫3只。2周后以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化蛋白分点皮下注射相同剂量，最后一次免疫，直接用生理盐水稀释蛋白皮下注射1 000μg的重组E2蛋白抗原。2周后采血测抗体效价。待抗体达到要求后杀兔采血，分离血清。将兔血清采用蛋白A(Protein A Sepharose)柱层析法纯化，纯化后的IgG用SDS-PAGE鉴定纯度和BCA试剂盒测定浓度后低温保存备用。

1．6  NP-40处理制备BVDV抗原

    将杆状病毒表达BVDV E2蛋白的sf9细胞接种至细胞培养瓶，待铺满整个瓶底时将细胞培养物反复冻融3次，1 503 g／min离心，收集细胞上清原液，加人1％细胞原液量含1％NP-40的PBS缓冲液，室温旋涡震荡1．5-2 h，然后601 g／min 4℃离心10min，上清作为被检阳性抗原，用同样方法处理的sf9细胞上清作为阴性对照。

1．7  单抗和多抗最佳使用浓度的筛选

    采用方阵滴定法，将纯化后的单抗和多抗分别稀释至20 μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、2 μg／mL、1 μg／mL、0．5μg／mL 6个不同浓度，包被酶标板，4℃过夜后，以1％BSA的PBS溶液37℃封闭1 h，用0．15％吐温-20的PBS洗3次后加入NP-40处理的BVDV细胞培养抗原，同时加入同种方法处理的正常细胞培养物做阴性对照，37 ℃作用1 h；用含1％明胶的PBS溶液37 ℃封闭1h；加入不同浓度的兔抗BVDVIgG(20、10、5和2μg／mL)，37 ℃作用1 h；洗涤后加入羊抗兔酶标抗体(Sigma)，37 ℃作用1 h；再次洗涤后加入新配的底物溶液TMB+H2O2，37 ℃作用15 min；用2mol／LH2SO4溶液终止后检测OD450值，确定抗体的最佳工作浓度。

1．8  单抗包被条件和多抗作用条件的确定

    采用方阵滴定法，将筛选的单抗和多抗分别按最佳使用浓度稀释，单抗采用37℃2 h、4℃12 h、4℃24h和37℃1 h后4℃ 12h4种包被条件，多抗则采用37 ℃分别作用2h、1 h和30min的工作条件，按1．7步骤进行ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，根据结果选择单抗的最佳包被条件和多抗的最适作用条件。

1．9  封闭剂的应用选择

    用单抗包被酶标板，分别用1％BSA、1％明胶、1％BSA+1％明胶、1％BSA+1％明胶应用2次(单抗包被后和待检抗原作用后)4种方式封闭，然后按1．7步骤进行ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，根据结果选择封闭剂的最佳应用方法。

1．10  酶标抗体工作条件的选择

  酶标抗体分别按1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀释，反应条件为37℃分别作用2h、1 h和30min，按1．7步骤进行ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，根据结果选择酶标抗体的最佳工作浓度和作用时间。

1．11  AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定

    以24份来自健康牛的脾脏组织悬液为待检测样品，进行上述AC—ELISA。每份样品重复2孔，在样品OD450值符合正态分布的条件下计算样品平均OD450值(x)和标准差(s)，按文献计算阴性样品的临界值。

1．12  AC-ELISA重复性试验

  用单抗包被4块酶标板，在每一块板内分别检测1份BVDV细胞培养抗原和4份牛病毒性腹泻病组织病料，同时用1份正常细胞培养物做阴性对照，每份样品在每块板中重复4孔，AC-ELISA方法进行检测。结果用SPSS软件进行统计学分析，计算样品OD450值在不同板间和板内不同孔间的变异系数，检验板内和板间检测样品的重复性。

1．13  AC-ELISA在临床牛病毒性腹泻病样品检测中的应用

    11份临床牛病毒性腹泻病疑似病例脾脏组织和12份健康牛脾脏组织，分别研磨匀浆后用1％NP-40处理，用AC-ELISA方法检测BVDV抗原，同时用正常细胞培养物做阴性对照。上述样品分别用病毒分离和RT-PCR方法平行检测做对比。

2  结果

2．1  单抗纯化鉴定和浓度测定

    纯化前后的单抗SDS-PAGE如图1，由图可见纯化后的单抗在68 ku和25 ku附近有两条明显的条带(分别是IgM的重链和轻链)，与预期的大小条带相符。而未纯化的泳道上出现多条杂带。表明单抗纯化结果较理想。

 

2．2  多抗效价测定、纯化和浓度测定

    采用倍比稀释法测得纯化后的多抗效价为1．2X10 4。纯化前后的多抗SDS-PAGE如图2，图中显示IgG在50ku和25 ku附近出现了明显的条带，代表IgG的重链和轻链，与预计大小相符，未纯化多抗则有很多杂带。表明上述纯化结果很理想。经BCA试剂盒方法测定多抗的浓度为9．08 mg／mL。

 

2．3  单抗和多抗最佳使用浓度的筛选

    方阵滴定法筛选单抗和多抗最适工作浓度，结果见表1。单抗4G3和兔抗BVDVIgG浓度分别为5和10μg／mL时，检测BVDV细胞培养抗原的OD450值为1．023，接近于1．0，且正常细胞培养物的OD450值为0．312，P／N值(3．278)最大，确定AC—ELISA试验中单抗和多抗的最适工作浓度分别为5和10μg／mL。

 

2．4  单抗包被条件和多抗作用条件的确定

    以最适单抗浓度采用37 ℃ 2h、4 ℃ 12h、4 ℃24h和37℃1 h后4℃12h4种包被条件，多抗则采用37℃分别作用2h、1 h和30 min 3种不同的工作条件，组成方阵进行AC-ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，结果见表2。

 

    单抗在4℃包被12 h，多抗在37 ℃作用1 h，BVDV阳性抗原OD450值1．032，阴性OD450值0．320，P／N值为3．225；单抗在4℃包被24 h，多抗在37℃作用1 h，BVDV阳性抗原OD450值1．066，阴性OD450值0．315，P／N值为3．384。此两种条件下的阳性抗原OD450值均接近1．0，P／N值均较大，单抗在4℃包被12—24h，多抗在37℃作用1 h可作为双抗体的最佳反应条件。

2．5  封闭剂的应用选择

    分别用1％BSA、1％明胶、1％BSA+1％明胶、1％BSA+1％明胶应用2次(单抗包被后和待检抗原作用后)4种方式封闭后进行AC-ELISA，分别检测NP-40处理的OD450值BVDV阴、阳性抗原，结果见图3，用1％BSA+1％明胶封闭2次，阳性抗原OD450值最高，阴性抗原OD450值最低，P／N值最大，为最佳封闭条件。

 

2．6  酶标抗体的工作浓度和工作时间的选择

  羊抗兔IgG分别做1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀释，在37℃分别作用2h、1 h和30 min，进行AC-ELISA，检测NP-40处理的BVDV阴、阳性抗原，结果见表3，酶标抗体按1：10000稀释后37 ℃作用1 h，测得BVDV阳性抗原OD450值最高，阴性抗原的OD450值较低，P／N值较大，为最佳反应条件。

 

2．7  AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定

    用AC—ELISA方法检测24份BVDV阴性的牛组织样品，其OD450值介于0．242和0．346之间(图4)。用SPSS 8．0软件进行统计学分析，24份样品的OD45。值符合正态分布，OD450值的平均数(x)和标准差(s)分别为0．301和0．031，根据文献计算阴性样品的临界值为x+3xs=0．393。根据统计学原则，OD450值>0．393时，可以在99．9％的可信度上判定为阳性，能够作为检测结果的判断标准。为了减少假阳性或假阴性结果，将临界值加上和减去1个标准差的范围作为一个可疑区间(即OD450值0．362—0．424)，介于可疑区间内的结果需要重检。

 

2．8  AC-ELISA方法的重复性试验

    用已建立的AC—ELISA方法对1份阳性抗原(BVDV细胞培养物)、1份阴性抗原(阴性细胞培养物)和4份疑似BVDV感染牛的脾脏组织分别在不同板间及板内不同孔间进行重复检测，结果见表4。根据SSPS 8．0统计软件中的随机单位组设计资料的S-N-K方差分析方法进行分析。不同板间比较，F=0．833，P=0．479>0．05；板内不同孔间比较，F=0．103，P=0．958>0．05。二者差异均无显著意义，说明AC-ELISA方法在不同板间和板内不同孔间检测同一样品差异不显著。根据公式CV=S／Xx100％计算，6个样品在板内和板间的总变异系数均小于10％，可见该方法无论对阴、阳性细胞培养抗原还是临床组织样品进行检测均具有较好的重复性。

 

2．9  AC-ELISA在临床牛病毒性腹泻病样品检测中的应用

    用AC—ELISA方法检测临床采集的牛病毒性腹泻病料，同时以病毒分离和RT-PCR方法检测做对比。用AC-ELISA、病毒分离和RT-PCR方法对11份临床牛病毒性腹泻病料的检测结果分别见表5，3种方法对12份健康牛组织样品的检测结果均为阴性。

 

3  讨论

    牛病毒性腹泻至今仍是世界范围内严重威胁养牛业健康发展的传染病，各国对该病都十分重视，投入很大的人力和物力进行研究。就目前BVDV的诊断技术研究水平来看，远远滞后于BVDV其他方面的研究进展，如何建立快速、准确的BVDV检测方法是当前BVDV防制工作的迫切要求。多年来，国内外先后建立了病毒分离、免疫荧光试验、单层免疫酶、酶联免疫酶和RT-PCR检测方法。ELISA方法以其快速、灵敏、简单并便于同时检测大量样品而受到人们的重视。目前国内BVDV检测方法还是以初步纯化的BVDV细胞培养物作为抗原检测BVDV抗体为主，缺乏理想的BVDV抗原检测方法。由于国外抗原检测试剂盒价格过于昂贵，在国内难以推广，建立一种敏感、快速、易操作的直接检测牛病毒性腹泻病抗原的试验方法已成为BVDV诊断工作的迫切要求。本试验用自行研制的BVDV单抗与兔抗BVDVIgG联合应用，建立了双抗体夹心间接ELISA方法用于捕捉BVDV抗原，将单抗的高度特异性和ELISA方法的高度敏感性有机地结合起来，达到了BVDV早期诊断和快速检测的目的。AC-ELISA方法具有快速、经济和敏感等优点，明显优于病毒分离、IPMA和IFA等，而且具有半自动化的特点，能自动显示结果，因此更适宜于短时间内检测大批量样品，适合于各级兽医研究机构和生产单位应用。

    在AC-ELISA方法的建立中抗体的亲合力是试验成功的关键，只有制备出高效价、高亲合力的特异性抗体才有可能取得成功。我们研制的单抗效价高，亲合力强，为方法的建立打下了良好的基础。同时制备了兔抗BVDV高免血清并纯化了IgG，取得了较好效果。

    非特异性反应是影响ELISA结果最重要的因素，特别是在双抗体夹心ELISA中，参与反应的成分多，需要多重抗原抗体反应步骤，因此降低非特异性反应尤其重要。在消除非特异性反应过程中，封闭剂的选择和合理应用非常关键。由于担心动物血清中未知杂蛋白含量过多，有可能对试验结果造成影响，本试验中采用BSA和明胶作为封闭剂，并进行了封闭方式筛选试验，确定了将1％BSA和1％明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭，取得满意效果。

    ELISA方法中结果的判定与特异性和敏感性密切相关，目前还没有统一的判定标准，一般公认的判定方法是通过检测大量已知的阴性样品，用统计学方法计算结果的平均数、平均数的99％可信区间和标准差，确定一个在99％的可信度上区分阴、阳性结果的临界值。张札壁报道对10份以上已知阴性样品分别检测，取OD值平均值加上3倍标准差的和可作为临界值，当被检样品的OD值高于此值时，可判定为阳性。本试验中应用24份经病毒分离和RT-PCR方法鉴定为BVDV阴性的牛脾脏组织分别用AC—ELISA方法进行检测，采用平均数加3倍标准差的方法确定样品阴性临界值为0．393，根据统计学原则，凡未知样品的OD值高于此值时，可以在99．9％的可信度上判定为阳性，能够作为检测结果的判断标准。此外，本试验还设定了一个可疑值范围，对介于可疑区内的样品进行重检，减少了假阳性或假阴性结果机率。

    总之，本试验建立的BVDVAC-ELISA方法将单抗的特异性和ELISA方法的敏感性有机地结合起来，能够短时间内准确、快速地直接检测大批量样品中的BVDV抗原，明显优于病毒分离和免疫荧光等方法，而且具有半自动化的特点，能自动显示结果，更适合于各级兽医研究机构和生产单位应用。 
 

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