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人胚胎干细胞的无饲养层培养实验
（参考冷泉港试验室protocol）
作者：Sohyun L. McElroy1 and Renee A. Reijo Pera
Center for Human Embryonic Stem Cell Research and Education, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University, Palo Alto, CA 94304-5542, USA
通讯作者邮箱： sohyun@stanford.edu 简介：
人胚胎肝细胞(hESCs)具有分化成内、中、外三个胚层和经体外长期培养而不断增殖的潜能。hESCs有着广阔的应用前景，它能作为“细胞源”用于新型疗法的测试、药物筛选和功能基因应用等领域；通过利用小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)或人来源细胞作为饲养层，可以维持hESCs未分化状态和增殖能力。以下试验方案中，我们描述了应用MEF条件培养系统为基质进行hESCs 无饲养层培养方法。此方法由于排除了饲养层细胞带来的污染问题，适用于hESCs的基因改造（genetic modification）等研究。
实验材料: 1. 所需试剂（所有溶液均需用0.2-µm过滤器除菌，然后4°C或按特别说明进行保存）：
1) bFGF solution (10 µg/mL)
2) Collagenase solution (1 mg/mL)
3) Freezing medium for primary cells
4) Gelatin solution (0.1%, w/v) for MEF
hESCs (cultured in a six-well plate)
Knockout DMEM (Invitrogen 10829-018) (chilled)
5） KSR medium for hESC
6） Matrigel stock solution
MEF feeder cells (irradiated CF1) as prepared in Preparation of Mouse Fibroblast Feeder Cells for Human Embryonic Stem Cell Culture (McElroy and Reijo Pera 2008a)
7） MEF medium for hESC
8） Phosphate-buffered saline (PBS) (1X) (Ca2+/Mg2+-free)
2. 实验设备
1) 离心管 (Falcon) 15mL
2） 10cm培养皿 (optional; see Step 1)
3） 过滤器(0.2-µm)
4） 培养箱（37°C, 5% CO2)
5） 液氮罐
6） 显微镜
7） 移液管 (5或10-mL) 或细胞刮片
8） 6孔细胞培养板
实验操作：
A.条件培养基(CM)的配制
1. 用处理过的MEFs（20,000 cells/cm2 in MEF medium）铺板/培养皿。请参考Culturing Human Embryonic Stem Cells with Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells (McElroy and Reijo Pera 2008b), 37°C 、5% CO2培养箱中培养过夜。
2. 第二天，倒去MEF培养液, 用1X PBS洗板/培养皿两次；倒去PBS后加入用于hESCs 培养的KSR medium (0.3 mL/cm2).
3. 24小时后，从培养板/皿中收集条件培养基（CM），加入4 ng/mL bFGF后用0.2-µm 过滤装置过滤除菌。
说明：条件培养基（未加bFGF）可以保存于–20°C备用。
4. 加入新的KSR medium到铺有MEF饲养层细胞的板/皿中, 可每天收集条件培养基。
说明：铺有MEF饲养层细胞的板/皿可用于生产条件培养基一周时间。
B．准备Matrigel基质包被板
5. 把Matrigel stock solution 放于4°C冰上缓慢解冻至少2 h ，以避免形成冻胶。
6. 把Matrigel stock solution与冰冷的knockout DMEM 1:15 混合稀释成工作液. 6孔板每孔加入1 mL Matrigel工作液进行包被.
7. 室温包被孵育1-2h或4°C包被过夜。
C. hESCs接种基质包被板进行培养
8. 吸去含有hESC克隆的6孔培养板孔中的培养基.
9. 每孔用2 mL 1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗两次。
10. 每孔加入 1 mL胶原酶溶液，37°C孵育10-15min。
说明：孵育时间长短取决于胶原酶的批次和hESC 细胞系。
11. 在细胞消化期间，用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗涤Matrigel基质包被板两次，然后每孔加入2mL的条件培养基（步骤3）。
12. 在显微镜下检查hESCs克隆。
说明：hESCs克隆看起来有些皱缩，其边缘有一定牵扯于板上，而不是完全脱离或漂浮于培养基中。若细胞克隆脱离，收集培养基并离心收获细胞。
13. 移去胶原酶溶液，并用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗板两次。
14. 每份（split）细胞加入1 mL条件培养基CM (例如：如果计划将细胞分成3份，则加入3 mL条件培养基).
说明：建议细胞分割比例为1:1 -1:3,主要取决于ESC克隆细胞浓度。 15. 小心地用移液管 (5或10-mL) 或细胞刮片吧细胞从板孔中刮取下来，转移孔中内容物到15-mL 离心管中。
16. 通过小心地吹打成小细胞团（约含50-500 cells ）；请注意不要把细胞处理成单细胞悬液。
17. 加入1 mL 包含有细胞的条件培养基到每孔Matrigel包被板孔中。
18. 把培养板放入培养箱中；可以通过在水平和垂直方向上倾斜摇匀数次，使小细胞团分散于培养基中。
19. 每天用2-2.5 mL新的加有4 ng/mL bFGF的条件培养基进行营养补给。
20. 当细胞融合度达到80%，进行传代培养。
参考文献：
1.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008a. Preparation of mouse fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5041
2.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008b. Culturing human embryonic stem cells with mouse embryonic fibroblast feeder cells. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5042.
3.Panula, S. and Reijo Pera, R.A. 2008. Preparation of human foreskin fibroblasts for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5043. |
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