【摘要】  目的：确定甘氨酰谷氨酰胺细菌内毒素鲎试验检查法的可行性。方法：供试品干扰试验后，采用凝胶鲎试验对样品中的细菌内毒素进行检测。结果：三批样品稀释至20 mg/mL、10 mg/mL时，对细菌内毒素的检测均无干扰作用，样品中细菌内毒素的含量均小于0.025 EU/mg。结论：所建立方法检查甘氨酰谷氨酰胺的细菌内毒素可行。

【关键词】  甘氨酰谷氨酰胺；细菌内毒素；鲎试验；干扰试验

细菌内毒素检查是药品一个非常重要的安全指标。特别对注射用原料药和注射用制剂药。近年来，世界各国越来越多地以细菌内毒素检查法检查药品和生物制品中致热物质来代替兔法进行热原检查。甘氨酰谷氨酰胺（GlycylGlutamine）溶解度大，进入人体内迅速水解为甘氨酸和谷氨酰胺而发挥作用。谷氨酰胺是人体内的一种条件必需氨基酸。临床上谷氨酰胺、酪氨酸与支链氨基酸以二肽形式应用于急性胰腺炎、肝、肾、骨骼肌患者的相应氨基酸供应，如复方氨基酸（15）双肽注射液。《中国药典》2005年版尚未收载该品种。我们对3批样品进行了细菌内毒素检测，以考察该方法的可行性。

　　1  药品与试剂
    　　
　　甘氨酰谷氨酰胺（四川思达康药业有限公司，批号：050701、050702、050703）；细菌内毒素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：20042）；细菌内毒素检查用水（湛江安度斯生物制品有限公司，批号：0504300）；鲎试剂（湛江安度斯生物制品有限公司，λ=0.25 EU/mL,批号：0510311），鲎试剂（湛江博康海洋生物有限公司，λ=0.25 EU/mL，批号：0602072）。

　　2  方法与结果

　　2.1  鲎试剂灵敏度的复核
    　　
　　照文献［1］附录规定的方法，对实验所用的鲎试剂（TAL）进行灵敏度复核。结果鲎试剂的实测灵敏度均在0.5～2.0 λ之间，符合规定。正式实验时取λ作为鲎试剂的灵敏度［2］。

　　2.2  样品细菌内毒素限值的确定
    　　
　　参照《中国药典》确定样品的细菌内毒素限值（L），L=K/M，K为人用每公斤体重每小时最大可接受的细菌内毒素剂量，非放射性药品静脉途径给药时K值为5 EU/(kg·h)，M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以mg/(kg·h)表示，人均体重按60 kg计算，甘氨酰谷氨酰胺现在临床最大用量约为50 mg/kg。L值应为6 EU/mg。参照《中国药典》2005年版二部甘氨酸原料细菌内毒素的限度值（0.02 EU/mg）［1］和临床用量，根据生产控制从严的实际情况，综合生产、临床用药和检验的实际情况，将甘氨酰谷氨酰胺的L值定为0.025 EU/mg。2.3  样品的干扰试验
    　　
　　确定最大有效稀释倍数（MVD），照文献［1］附录规定样品为原料药，MVD取1，可计算样品的最小有效稀释浓度c=λ/L，用λ=0.25 EU/mL鲎试剂进行干扰试验时，即样品最小稀释浓度为10 mg/mL，将样品稀释至40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL浓度。取“2.1”项下鲎试剂，分别对3批已检测细菌内毒素不超标的样品，进行细菌内毒素干扰试验。样品在表1所述3种浓度下，对细菌内毒素检查均无干扰［2］。表1  样品的干扰预试验(略)

　　参照文献［1］取2个厂家灵敏度为0.25 EU/mL的鲎试剂，分别对3批样品浓度为20 mg/mL、10 mg/mL进行细菌内毒素干扰试验确认，并计算以样品稀释液配制的细菌内毒素溶液反应终点浓度的几何均值（Et）及细菌内毒素检查用水配制的内毒素溶液反应终点浓度的几何均值（Es），结果见表2。表2  干扰试验（略）

    通过上述干扰试验的结果表明，供试品在20 mg/mL、10 mg/mL浓度下，进行干扰试验时，其Et与相应的Es均在0.5～2.0之间，且Es在0.5～2.0 λ之间，说明供试品在20 mg/mL、10 mg/mL对细菌内毒素检查均无干扰。

　　2.4  样品中细菌内毒素的常规检查
    　　
　　参照文献［1］，取上述3批甘氨酰谷氨酰胺稀释至10 mg/mL后，以λ=0.25 EU/mL的鲎试剂，按常规凝胶法进行细菌内毒素检查（表3）。结果样品在10 mg/mL中的细菌内毒素含量均小于0.025 EU/mg，且对鲎试验检查无干扰作用。表3  样品中细菌内毒素的常规检查（略）

　　3  讨论
    　　
　　凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法，条件是适宜的温度、pH值及无干扰作用。因此，新药品种是否可用细菌内毒素检查法替代兔法热原检查，首先要证实是否存在干扰因素，确定该品种在有效浓度范围内进行细菌内毒素检查时既可以克服干扰因素，又能客观地反映其所含细菌内毒素的限值［3］。在确定了甘氨酰谷氨酰胺的细菌内毒素限值为0.025 EU/mg后，取3批样品，用2个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素的干扰试验。结果表明样品在20 mg/mL、10 mg/mL对细菌内毒素检查均无干扰作用。从而证实可以建立该品种的细菌内毒素检查法，其细菌内毒素限值应小于0.025 EU/mg。

【参考文献】
  ［1］中华人民共和国国家药典委员会. 中国药典［S］. 二部. 北京: 化学工业出版社, 2005: 附录70, 8687.

　　［2］肖贵南, 李瑾翡, 吴招娣. 鲎试验测定乙酰谷酰胺氯化钠注射液中的细菌内毒素［J］. 华西药学杂志, 2006, 21(40): 390391.

　　［3］肖贵南, 区 璇, 陆惠文, 等. 盐酸普罗帕酮注射液细菌内毒素的鲎试验研究［J］. 中国药理学通报, 2004, 20(2): 226229.

   （作者：刘华，黄明，周莉）

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