关 舒 胡新旭 马秋刚 王 宁 计 成
摘 要 黄曲霉毒素B1具有高毒性、高致畸性和高致突变性，是危害最大的真菌毒素之一。黄曲霉毒素污染严重威胁动物的生产性能和人类健康，每年给饲料工业和畜牧业生产带来巨大的经济损失。对黄曲霉毒素污染的控制急需一种安全、高效而且环保的解毒方法。文章对传统去毒方法和新型生物技术降解黄曲霉毒素的研究进行了综述。
关键词 黄曲霉毒素；解毒；生物技术
中图分类号 S816.33
Aflatoxin detoxification by traditional methods and biological technology
Guan Shu, Hu Xinxu, Ma Qiugang, Wang Ning, Ji Cheng
Abstract Aflatoxin B1(AFB1), one of the most hazardous mycotoxins, is extremely toxic, mutagenic and carcinogenic. It poses severe threat to both livestock productivity and human health and thus, brings huge worldwide economic losses each year. A safe, effective and environmentally sound detoxification method is urgently needed for controlling this toxin. Researches on aflatoxin detoxification by traditional methods, as well as biological strategies are reviewed in this study.
Key words aflatoxin；detoxification；biological technology
1 黄曲霉毒素的危害
黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)真菌产生的次级代谢产物，具有极强的毒性。其中，黄曲霉毒素B1(AFB1) 毒性最强，具有致癌、致畸和引起肝脏损伤的作用（Guengerich等，1996）。
AFB1广泛存在于饲料原料中,如花生粉、豆粕、棉籽粕、玉米、高粱等。到目前为止,黄曲霉毒素仍是对畜牧业威胁最大的霉菌毒素之一,各种动物对黄曲霉毒素均具有很高的敏感性。Madden等(1999)报道,日粮中含0.2 mg/kg黄曲霉毒素即可引起家禽采食量和增重降低,降低程度与黄曲霉毒素浓度有关。AFB1可引起鸡细胞免疫抑制,外周血液中T淋巴细胞数量减少,白细胞和球蛋白值降低,生产性能和免疫功能下降。Prasad(2002)研究了AFB1对家禽的影响发现,单一剂量AFB1的平均半致死量(LD50)(mg/kg体重)鸡6.5~16.5、鸭0.34，鸭比鸡更敏感,特别是雏鸭。对于生长禽日粮中的AFB1的安全值,一般认为不应超过20 μg/kg。猪对AFB1也很敏感，尤其是哺乳母猪和仔猪。母猪采食受AFB1严重污染的饲料,母乳中会出现高水平的AFB1,进而对哺乳仔猪产生影响。研究表明,日粮中AFB1浓度为20～200 μg/kg可引起母猪采食量和生产性能下降,1 000～5 000 μg/kg时可致中毒。家畜对黄曲霉毒素的易感性其顺序是:小鸭>鸡>小猪>犊牛>肥育猪>成年牛>绵羊。有研究发现，通过食物链进入人体的黄曲霉毒素具有极强的致癌作用,严重威胁人类健康。
2 黄曲霉毒素常规去毒方法
2.1 碱处理法
碱处理法包括氨化法和氢氧化钠法。Mukendi 等（1991）报道了使用亚硫酸钠、硫酸氢钠、氢氧化钠、氨等化学试剂对黄曲霉毒素去毒的研究,并分析了影响这些化合物去毒效果的各种因素。Natarajan等(1992)研究了氯化剂、碱类(氨、甲氨、氢氧化钙)以及醛类(甲醛)对黄曲霉毒素污染的花生粉的去毒作用,并研究了这些化学试剂对花生粉的理化性质的影响。碱处理法适合应用于含水量较高的青绿、青贮饲料以及液态粮油，去毒效率高，但不适合籽实、饼粕等大部分固体饲料原料，而且处理后原料残留有大量氨。由于该方法使用的设备投资大，成本高，已逐渐被淘汰。
2.2 氧化处理法
常用氧化试剂有次氯酸钠、臭氧、过氧化氢、氯气等。Patel等（1989）报道,若同时使用过氧化氢和γ-射线照射则可以更有效地降低黄曲霉毒素的毒性，如4 000 Gy的γ-射线和5%过氧化氢可使100 pg的黄曲霉毒素完全灭活。此外紫外光照射法也是利用紫外线的强氧化作用去毒。但是该方法主要问题在于处理效果不稳定，饲料中维生素等营养成分损失严重，处理成本较高(Rustom，1997；Albores等，2005)。
2.3 吸附剂脱毒
常用吸附剂包括酵母细胞壁、硅铝酸盐、活性炭等。国外有报道称以硅藻土作吸附剂除去花生油中的黄曲霉毒素比较有效。Phillips等(1995)报道了使用偶联有化学配基的硅藻土选择性吸附黄曲霉毒素并进一步进行化学解毒的方法,效果良好。但是使用吸附剂不能解除黄曲霉毒素的毒性，它可能同时吸附饲料中的营养成分而降低营养物质的利用率，而且被吸附的毒素有可能在动物胃肠道中重新释放。饲料行业目前采用这种方法较多，也有许多新型的吸附剂问世,但其应用效果还有待考察。
2.4 抗氧化剂
Hayes等（1992）报道，含化学抗氧化剂的饲料能增强大鼠抗AFB1的能力,这类抗氧化剂包括2-叔丁基对甲酚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、异硫氰酸苄酯、2,2,4-三甲基-6-乙氧喹啉等。其机理是抗氧化剂能促进大鼠体内α-谷胱甘肽转移酶-YC2亚基的表达,有效地抑制了AFB1与机体DNA的结合。但是抗氧化剂的去毒作用有限，不能完全消除黄曲霉毒素中毒症，而且BHT等抗氧化剂浓度均超过常规使用量的30倍以上才显示较好的去毒效果，这样对动物具有一定毒害作用(Fanelli等，2003)。
2.5 高温处理法
高温处理法包括高温烘烤、蒸煮或日光照射等。破坏AFB1需268 ℃以上的温度，能耗高且对饲料中的营养成分破坏大，实际应用很少(Hassan等，2005；Yazdanpanah等，2005；Gowda等，2007)。
2.6 合格原料稀释法
这种方法虽然能够有效减轻动物中毒症状和生产性能抑制，但有可能造成毒素污染范围的扩大。
目前有很多描述物理和化学方法去除黄曲霉毒素的报道。但是以上每种方法都存在一些问题，如导致饲料中的营养损失，影响饲料的感官品质，有些方法所需要的设备价格昂贵等等，从而限制了其在实际生产中的应用（Piva 等，1995）。
3 黄曲霉毒素生物降解
Bata等(1999)提出有效的霉菌毒素去毒方法应该满足以下几点要求：毒素应该被破坏或者被转化成无毒化合物；真菌孢子和菌丝体应被破坏,这样就不会有新的毒素产生；饲料应该保持它原有的营养水平和风味；原料的物理性状不应被明显改变；去毒加工应该经济可行。
利用微生物或其代谢产物进行解毒具备高效率、特异性强，以及对饲料和环境没有污染的优势，代表了生物解毒的新方向。研究发现，生物酶解毒具有对饲料无污染、有高度的专一性,不影响饲料的营养价值,而且能够避免毒素的重新产生等优点(Mishra等,2003)。于是近些年生物酶解毒法成了研究的热点。
3.1 微生物吸附黄曲霉毒素
许多微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌菌丝体都能吸附真菌毒素。乳酸菌属的许多菌株，包括Lactobacillus（El-Nezami等,1998；Gratz等，2005）、Bifidobacterium(Peltonen等,2000；2001)、Propionibacterium(El-Nezami等,2000)和Lactococcus(Pierides等，2000)等都被报道具有吸附黄曲霉毒素的作用。朱新贵等(2001)报道了乳酸菌、醋酸菌、面包酵母菌、酿酒酵母菌、米曲霉和枯草芽孢杆菌均对黄曲霉毒素有去除作用，但由于是用带有活菌的发酵液进行实验，所以其作用机制很可能是菌体的吸附作用。在以上这些微生物去毒的过程中，活菌细胞的存在是必要条件。但是以上很多试验都证实，这种吸附作用是可逆的，毒素分子并没有消失，随着培养时间的延长，部分毒素会重新释放到培养基质中。所以，微生物吸附去毒并不是很理想的解毒方法。
3.2 微生物代谢产物降解黄曲霉毒素
近年来，有越来越多的研究报道了微生物或其代谢产物降解黄曲霉毒素。根据解毒菌的种类，大致划分为真菌和细菌。
3.2.1 真菌及其代谢产物降解黄曲霉毒素
早在20世纪70年代末，Doyle等(1979)就发现了寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)能够产生降解AFB1的过氧化物酶,并报道过氧化物酶的量与AFB1被降解的量之间存在着直接的关系。 之后Huynh等(1984)报道，黑曲霉(Aspergillus niger)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、绿色木霉(Trichoderm viride)、毛霉菌(Mucor ambiguous)以及少数其它真菌对AFB1也有很好的降解能力，但其中的一些菌株在条件改变的情况下有可能产生AFB1。Marisa等(2003)从白腐真菌和褐腐真菌的代谢产物中分离出了胞外解毒酶，研究了该酶解毒反应的最佳pH值和温度,并将其纯化。近年来,很多研究发现真菌的代谢产物能够降解黄曲霉毒素,这些真菌包括 Trametes versicolor(Zjalic等，2006)、Rhizopus sp., Mucor sp.(Varga 等,2005)以及一些酵母菌,包括Trichosporon mycotoxinivorans(Molnar等,2004)、Saccharomyces cerevisiae(Shetty等，2006)和Trichoderma属的菌株(Shantha等，1999)。
国内刘大岭研究小组开展了比较多的工作，并取得了显著成果。他们发现从假密环菌(Armillariella tabescens)中提取的粗酶液可使样品中的AFB1含量减少80%。活性物质解毒作用的温度、pH值、时间等特征表明, 粗酶液中起解毒作用的可能是某种酶。随后，他们从该真菌的菌丝提取物中分离出一种可以脱除黄曲霉毒素毒性的解毒酶，克隆得到其基因序列,成功转化到毕赤酵母表达系统中，并对该酶的固定化技术进行了研究。然而以上解毒酶的理想反应条件都是中性pH值、高水分的体外反应体系，适合植物油、酱油、啤酒、牛奶等，难以在籽实、饼粕等低水分饲料原料中直接应用 (刘大岭等,1995；Liu等，1998、2001)。陈仪本等(1998)研究发现，黑曲霉(Aspergillus niger)菌丝体提取物能够降解花生油中的黄曲霉毒素。这种活性物质的解毒作用效率高，且通过温度、水分、时间等对其解毒反应的试验表明，降解过程是酶促反应。考虑到酶促反应必须在水的存在下发生反应，该研究小组选择了谷壳培养法将解毒酶固定化，从而解决了酶制剂在含水量低的环境下难以作用的难题。
上述真菌的解毒作用绝大部分源于细胞内提取物，由于操作过程需要破碎真菌细胞或菌丝体，程序繁琐，限制了实际应用。
3.2.2 细菌及其代谢产物降解黄曲霉毒素
细菌及代谢产物降解黄曲霉毒素的报道并不多。目前已有的报道均显示,解毒作用源于胞外代谢产物。
Ciegler等（1996）曾报道，Nocardia corynebacterioides和Mycobacterium fluoranthenivorans菌均可以有效的降解AFB1。Line等（1994）使用14C标记AFB1与橙色黄杆菌(F. aurantiacum)反应并对放射性物质进行追踪和检测，研究发现，无论活细胞还是死细胞均能够降低AFB1含量，但活细胞的作用远大于死细胞，并且只有活细胞释放了被标记了的CO2，这表明一定量的AFB1被菌体细胞所代谢。这种方法也为研究AFB1在动物体内的代谢途径提供了参考。此外, 他们还发现从橙色黄杆菌提取的粗蛋白物质在水溶液中可以降解74.1%的AFB1，而用热处理失活的粗蛋白只能降解5.5%的AFB1。用脱氧核糖核酸酶I处理粗蛋白后发现可以降解80.5% 的AFB1，而蛋白酶K处理后降解率降低到34.5%，这表明橙色黄杆菌对黄曲霉毒素的解毒作用可能是酶促反应。Smiley等(2000)也发现一株橙色黄杆菌(F. aurantiacum)的粗蛋白提取物在水溶液中可以降解AFB1，并推测是酶促反应。
Teniola等(2005)报道了4株具有降解AFB1活性的菌。其中，红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)和Mycobacterium fluoranthenivorans菌的胞外提取物在30 ℃分别与AFB1反应4 h后，降解率都在90％以上，8 h后基本检测不到AFB1残留。胞外提取物在热处理和蛋白酶K处理后解毒效率大大降低，从而推断解毒过程是酶促反应。该研究小组还对红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)解毒酶的特性进行了研究(Alberts等，2006)。
以饲料、土壤、动物粪便和植物腐殖质等65个样品为基质,广泛筛菌并获得25株具有降解黄曲霉毒素作用的细菌纯培养物。其中源自南美貘粪便的一株细菌[鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)]具有很强的解毒能力，其胞外代谢产物在72 h 内能降解78.7% 的黄曲霉毒素，而活菌细胞和胞内提取物均无解毒活性；蛋白酶K 和热处理后的提取物解毒能力消失，并且解毒反应受温度、pH值和金属离子的影响，从而推测起解毒作用的物质很可能是酶（Guan等，2008）。对该解毒酶的层析和蛋白质电泳研究表明，起解毒作用的酶至少有三种，为混合酶。进一步的研究将对解毒酶加以纯化，并试图寻找解毒酶基因，通过分子生物学技术进行高效表达。
4 结语
经研究表明，黄曲霉毒素可以通过生物酶降解作用得以去除。在温和的条件下生物酶的解毒不会产生其它有毒的化学物质，也不会损失或极少的损失饲料中的营养物质。虽然黄曲霉毒素的生物降解研究已经有了很大进展，但是由于酶作用条件苛刻等原因，离实际生产应用还有一定距离。目前，在国内外使用生物学方法降解黄曲霉毒素在饲料工业中的应用刚刚起步。应用生物学方法降解黄曲霉毒素的技术关键在于筛选出能产高活性解毒酶的菌株，并在饲料中创造一个有利于酶促反应的含水微环境。因此，筛选出高效产酶菌株，通过酶工程、基因工程等手段获得解毒作用条件宽的解毒酶是今后研究的方向。

（参考文献44篇，刊略，需者可函索）
（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

关舒,中国农业大学动物营养学国家重点实验室，100193，北京市海淀区圆明园西路2号。
胡新旭、马秋刚、王宁、计成(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2008-11-03
★ 国家自然科学基金（30571353）