作者：陆亭屹 徐萍    作者单位：黔南州疾病预防控制中心,贵州 黔南 558000

　HIV抗体检测是发现HIV感染的有效途径，而对疑似艾滋病HIV感染者的实验确诊是防治艾滋病的重要环节。随着我国HIV感染人数的逐年增加，人们对艾滋病病毒的检测日益重视。酶联免疫吸附法(ELISA)检测HIV抗体是卫生部推荐的首选方法，此法特异性强，灵敏度高，操作简单易行，既适宜于大样本的筛查试验，也可用于单个样本的测定，但检测结果的正确性易受多种因素的影响。为进一步提高HIV初筛实验室质量，保证检测结果的准确性，最大限度减少HIV抗体检测可能出现的误差，本文对实验室中溶血血清、不同的血清量、温育时间、终止比色时间等影响的因素加以探讨。

　　1  材料与方法

　　1.1 仪器   

　　BIO-R55O型酶标仪(美国产)；Fluido型洗板机(郑州产)；干式孵育箱(上海市医疗器械厂生产)；E06010122型移液器(日本产)。

　　1.2 试剂  

　　A试剂:北京万泰公司生产的ELISA抗2HIV(1＋2)抗体试剂盒(批2批检合格，批号20070909)。B试剂:新创公司生产的ELISA抗2HIV(1＋2)抗体试剂盒(批2批检合格，批号2007076605)。由贵州省疾控中心艾滋病防治所供给。

　　1.3 样品  

　　取自都匀市少管所监测点的HIV抗体初筛阳性血清。

　　1.4 方法  

　　取10份HIV初筛的阳性血清，每份血又分为两份，一份是正常分离的非溶血血清，另一份是通过人为机械溶血分离的血清。用两个不同生产厂家的ELISA抗2HIV(1+2）试剂盒，操作严格按照试剂说明书进行，在有效期内使用。在相同的温度下，对同一样品进行不同血清(非溶血与溶血)、不同血清量(万泰100 μl全量、50 μl，新创50 μl全量、25 μl)、不同温育时间(37℃温育30 min与20 min及加终止液后立即比色，5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min等不同时间比色进行比较。判断临界值的设定北京万泰为Cut off值=0.12+N(阴性对照平均值), 英科新创为Cut off值=0.10+N(阴性对照平均值)，样本OD值小于Cut off值为阴性，大于或等于Cut off值为阳性。

　　2   结果

　　2.1 两种试剂同时测定非溶血与溶血样本HIV抗体,两样本的OD值差异均无显著性(P>0.05)，与有关报导不同[1,2](见表1)。
表1   非溶血与溶血血清OD值比较略（

　　2.2 不同温育时间的比较  

　　两种试剂的结果各不相同，A试剂非溶血与溶血样本37℃温育30 min和20 min之间OD值差异无显著性(P>0.05)。B试剂37℃温育30 min和20 min之间OD值差异有显著性(P<0.01,见表2)。表2   不同温育时间OD值比较 （略）

　　2.3 HIV抗体阳性血清样本不同血清量结果OD值差异均有显著性(P<0.05,见表3)。表3  不同血清量OD值比较（略）

　　2.4 加终止液后用双波长(450 nm,630 nm)在不同时间扫描(比色)对结果的影响

　　加终止液后随着时间的增加，OD值逐渐下降，而且浓度越高其OD值随时间下降越快。在本实验中发现弱阳性的HIV质控血清，其OD随时间增加而变化较小。阳性血清OD值比色时间延迟 5 min后，各时间段与第一次相比 ,结果有明显变化(见表4)。从表中看出比色时间对ELISA的检测结果影响明显。表4   不同时间比色OD值两两比较（略）
　　3  讨论
 
　　在ELISA试验中溶血标本对HBsAg和麻疹抗体测定的影响均有报道[3,4]， 对HIV抗体测定的影响报道少见，本次实验用A、B两种试剂对非溶血和溶血标本测定HIV抗体的OD值比较，两种血清OD值结果间差异均无显著性(P>0.05)，虽然溶血标本对ELISA测定HIV抗体结果影响较小，但在测定HIV抗体时，抽血和分离血清应尽量避免溶血，但对抽血困难和运输过程中造成个别溶血标本应多次反复测定，警惕假阳性出现，以保证结果的准确性。
 
　　温育时间是影响ELISA法测定HIV抗体结果可靠性的关键因素之一。温育时间不够，会导致弱阳性样本漏检，温育时间过长，液体蒸发，使非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。在相同温度下，不同温育时间的OD值比较，万泰试剂与新创试剂的结果有所不同，说明不同生产厂家的试剂对温育时间敏感性不同。因此，在实验过程中应按说明书步骤严格控制温育时间，以保证实验的准确性。
 
　　本次结果表明阳性血清量的多少对结果的准确性影响很大。笔者认为：操作过程中样本及试剂应垂直加样，不可太快，若加样过快，容易溅出和产生气泡，难以保证加样量的准确性。 非垂直加样易加在微孔非包被区，致非特异性吸附. 加样过猛易使样本(试剂)溅出对邻近孔产生污染，产生气泡使液面差异致酶标仪测定出现误差，为确保加入试剂的准确性，应使用精密移液器,不可使用滴瓶滴加。
 
　　从表4可见，加终止剂后，在不同时段读取各孔OD值与第一次进行比较，结果差异有显著性 (P<0.01)。各时间段与前一次比较，A试剂10 min以后各时段与前一次比较差异均无显著性(P>0.05)，而B试剂25 min以前各时段与上一次比较差异均有显著性(P<0.01)。说明不同生产厂家的试剂在加终止液后随着时间的增加，OD值下降的速度不同。目前各生产厂家的HIV抗体筛查试剂，加终止剂后没有规定具体的比色时间，建议各试剂生产厂家应对其最佳的时间加以说明。本次结果显示，加终止剂后5 min比色结果比较理想，实验样本数量有限，有待大样本证实。
 
　　掌握HIV初筛实验室基本操作技能和技术，每一步操作应认真仔细，严格按说明书进行对操作环节各方面的影响应全面的了解，并能进行有效控制，提高HIV初筛实验室的HIV抗体检测准确率，为艾滋病的控防工作提供科学依据。

【参考文献】
  　　[1] 殷勤. 溶血对抗-HIV测定结果的影响[J].实用医技杂志,2004，11(10):2142-2143.

　　[2] 刘国刚, 钟海明, 胡金元.ELISA法检测HIV抗体的几点体会[J].中华医学实践杂志,2004,3(10):907.

　　[3] 钟筑宁, 谷俊莹, 肖文革. 对影响ELISA实验质量的有关因素分析[J].贵州医药,2005,29(12):1131-1132.

　　[4] 黎剑华, 郑泽红.酶联免疫吸附实验一步法检测麻疹IgM抗体影响因素探讨[J].中华现代儿科学杂志,2005,2(7):642-643.

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