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细菌内毒素(endotoxin)由革兰氏阴性菌所产生、存在于菌体内的一类毒素,是菌体细胞壁的组成成分。细菌在生活状态时不释放,只有当菌体自溶或用人工方法使细胞裂解后才可释放出来,它不是细菌的代谢产物。细菌内毒素的化学成分是磷脂-多糖-蛋白质复合物,其中主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),位于细胞壁的最外层,覆盖在细胞壁的粘肽上。脂多糖由三部分组成:O-特异性链、核心多糖和类脂A。
O-特异性链:向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链,具有特异性。
核心多糖:分为内核心及外核心,外核心由数种单糖,包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的KDO(3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖)。KDO以不耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G-菌都有此结构。
类脂A:位于最外层,具有致热作用,是细菌内毒素的毒性成分。游离的类脂A含有疏水性的中心及亲水性的边缘,是一种双相分子,可自身凝集成高分子的复合物,其分子量大小不等。
LPS是由亲水性的多糖和疏水性的类脂A结合构成的一种两性大分子物质。在LPS分子内,亲水性基团与疏水性基团在空间结构上位于分子两端,因此,在极性溶媒和非极性溶媒中均能形成微粒样多聚体。在水溶液中形成的LPS微胶粒,疏水性的类脂A位于多聚体的内部,亲水性的多糖位于多聚体的外侧(而在脂溶性的溶剂中则相反),其分子量可增大到1×108,在电镜下呈清晰的微胶粒。在水溶液中,由于多聚体亲水表面富含酸性基团,使得高分子LPS多聚体带有负电荷。因此,LPS微胶粒能与溶媒中的Mg2+、Ca2+结合,从而增强了LPS微胶粒的结构稳定性。表面活性剂与溶媒中的Mg2+、Ca2+可影响LPS微胶粒的聚合状态。通常在无表面活性剂存在 的溶液中,LPS多聚体的分子量超过1×106;在 表面活性剂存在时,LPS多聚体被解聚成(1~2)×104的微胶粒。
LPS的集聚程度对于其生物学活性有非常显著的影响。在测定LPS的活性时,必须以LPS溶解状态为前提。在水溶液中形成的LPS微胶粒,由于其主要活性部分类脂A不暴露于水溶液中,因此必须采用一系列的方法使LPS多聚体解聚。
对于某种特定的LPS,由于集聚程度的不同,生物学活性可强弱不一。低集聚度的LPS分子表现较强的毒性。相反,高集聚状态的LPS多聚体,由于易被细胞吞噬清除,表现出较低的毒性。不同方法提取的LPS毒性强弱不等,酸法提取的LPS,由于部分a-糖苷键被裂解,形成较多游离的类脂A,因此,酸法抽提的LPS毒性较酚法提取的低。LPS其他生物学活性,如致有丝分裂反应及鲎试剂凝集反应等活性,也受到LPS集聚程度的影响,聚合状态的LPS不能与鲎试剂发生凝集反应,必须通过各种方法将其解聚,变为LPS单体才能较好地使鲎试剂凝集。
在LPS标准品溶解时,往往不能确定其微胶粒状态是否被完全解聚,用旋涡振荡器一般可以达到解聚的目的。如有条件可用20KHZ左右的声波对LPS微胶粒进行解聚,通过此种方法可得到均匀分布的LPS单体溶液,但此种单体溶液在溶液中仅能维持约10min左右。
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