| |
抗生素治疗导致细菌内毒素释放的研究进展
中华外科杂志 1998年第0期第36卷 综述
作者：李晋 彭毅志 肖光夏 吴其林
单位：610083 成都，成都军区总医院烧伤科(李晋、吴其林)；重庆第三军医大学西南医院烧伤研究所(彭毅志、肖光夏)
由革蓝阴性(Gˉ）细菌引起的各种感染仍是目前临床上主要的并发症和死亡原因之一。即使在应用各种广谱、高效抗生素治疗感染取得巨大进步的今天，对抗菌治疗中产生的一系列严重反应，如发热、中毒性休克及多器官功能衰竭（MOF）等，仍然没有取得防治的根本性进展。其中抗生素治疗中导致G细菌释放内毒素（lipoplysaccharide，LPS），以及由其引起的严重损害存在着十分复杂的作用机理没有完全阐明，是一个主要原因［1］。梅毒患者用汞剂治疗后可出现发热等症状加剧的反应，称为雅-赫二氏反应（Jarish-Herxheimer raction）。自五十年代以来，在抗生素治疗的患者中，因Gˉ细菌裂解释放出大量LPS造成临床症状恶化的证据，先后在布鲁氏菌、脑膜炎双球菌和Gˉ细菌肠脓毒症的患者中得到证实。自那以后，大量的实验证实，抗生素治疗中可以引起Gˉ细菌LPS释放，作用于单核巨噬细胞介导多种炎症因子释放，如：TNF-α、白细胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8、前列腺素、凝血素、干扰素、血小板基激活因子等。这些因子适量时可激活免疫系统，产生杀灭微生物的有益作用。过量时可引起机体严重病理生理反应，表现为发热、低血压、心动过速、休克、MOF及死亡［6，7］。医学抗生素分册，1996,17：192-195.
一、LPS及其作用原理
1．LPS结构特点：LPS为Gˉ细菌外膜中的脂多糖成分。它由三部分组成：（1）O-特异性侧链；（2）核心多糖；（3）类脂A。O-特异链由20～40个重复单位组成，每个重复单位由3～7个糖分子组成。它是细菌表面的主要抗原，决定型的特异性。核心多糖可分为连接O-特异链的外核部分和连接类脂A的内核部分。核心多糖相对稳定，同一菌属结构相同。内核部分含有庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸（KDO）两种特殊的糖类分子。它们在LPS结构中起着连结多糖与类脂的作用。类脂A由2个葡萄糖脂、磷酸盐和一定量的脂肪酸组成，为LPS分子中最稳定的部分；各类Gˉ细菌均相同，它是LPS的主要毒性成分。目前认为在LPS中只有类脂A和KDO具有毒性。LPS的共同抗原在类脂A/KDO区，常被O-特异链遮盖而处于隐蔽状态［2，3］。
2．LPS与结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）、糖蛋白CD14：LBS为血清中一种糖蛋白，分子量为60000U，在肝细胞合成。LBP对各类细菌的类脂A均具有高度亲和力，能与LPS结合形成LPS-LBP复合物，促进LPS与单核巨噬细胞上的CD14结合。正常情况下含量较低，在应激状态下其含量可明显增加。CD14是一种分子量为55000 U的糖蛋白，借助磷酸酰肌醇聚糖锚吸附于单核巨噬细胞膜表面，为LPS-LBP复合物的受体。当LPS-LBP复合物与CD14结合后，激活有关酶系统，促进单核巨噬细胞合成、分泌多种细胞因子，如：TNF-α、IL-1、IL-6等，TNF-α被公认为引起内毒素休克、MOF等炎症反应的主要因子。目前认为LPS的毒性作用，主要是通过LBP和CD14这一途径实现的。因为LPS-LBP复合物诱导巨噬细胞产生TNF-α的能力是单一LPS的1000倍［4，5］。
3．LPS释放与炎症反应:早在一个世纪前，Jarish和Herxheimer就发现
二、不同种类抗生素影响Gˉ细菌LPS释放的主要机理
1．抑制蛋白质合成类抗生素与LPS释放:氨基糖甙类、氯霉素类和喹诺酮类抗生素能够抑制细菌蛋白质的合成，导致生长停止、增殖减慢而死亡。因而这类抗生素在多数实验中显示了释放LPS缓慢，释放量较其它种类抗生素低的特性。环丙沙星由于能引起细菌丝状改变，仍可导致LPS的大量释放。另外一些研究发现，G－菌的外膜表面存在钙、镁阳离子。正常情况下它们起连接LPS与磷脂分子的桥梁作用，能稳定LPS分子。当去除这些离子后，LPS会变得不稳定而释放出来。庆大霉素和环丙沙星可与钙离子络合，引起LPS释放。这种作用能被过量的镁离子所抑制。使细胞成分改变，造成膜的损伤，也是氨基糖甙类抗生素的作用机制之一。一些研究者认为，氯霉素引起的脑膜炎双球菌释放LPS，也是由于细胞膜的损伤，造成膜成分改变，使细菌细胞壁丧失了LPS的结合力所致。环丙沙星引起的细菌丝状改变的机理不明［8～10］。
2．干扰细胞膜通透性类抗生素与LPS释放：Gˉ细菌细胞壁较薄而疏松，粘肽只占细胞壁的10%～20%。而含有大量的LPS、脂蛋白和双层磷脂的外膜，其内侧为含类脂质的胞浆膜。多粘菌素B等多肽类抗生素由肽键连接的环状高分子化合物组成，结构中有游离的-NH2和-COOH。带正电的-NH2与Gˉ细菌胞膜中磷脂上带负电的PO4-3结合，改变了细胞膜的通透性，使菌体内的氨基酸、核酸、K+等成分外漏而死亡。LPS中的类脂A也含有PO4-3，故认为多肽类抗生素具有中和LPS的能力。许多实验已证实多粘菌素B作用于Gˉ细菌后，仅引起低而缓和的LPS释放。细菌释放出的LPS激活单核巨噬细胞释放TNF-α，这一作用可被多粘菌素B抑制。如在用B型嗜血流感杆菌为模型的动物实验中，单用头孢他啶治疗时，血中的TNF-α显著增加，加用多粘菌素B后便抑制了约98%的TNF-α释放。表明多粘菌素B能够中和及减少Gˉ细菌释放LPS，因而阻断了由其引起的TNF-α释放。最近发现氨基糖甙类也能结合LPS，但作用明显不如多粘菌素B［11，12］。
3．青霉素结合蛋白与LPS释放：传统理论认为，β-内酰胺类抗生素的主要杀菌机制是抑制细菌细胞壁的合成。因为这类抗生素都含有一个β-内酰胺环，与细菌N-乙酰胞壁酸五肽的最后二肽，即D-丙氨酰酸相似，能竟争结合转肽酶，形成青霉噻唑酶，使其失活，转肽过程中止，使细菌细胞渗透压增高裂解而死亡。青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）是细菌胞浆膜上的一种微小蛋白质，分子量在30000～150000 U之间。各种细菌PBPs谱不同，约3～10种，主要有6种，按分子量由大到小排序为：PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5、PBP6。有的还有亚型：如PBP1a、PBP1b、PBP1c等。通过对底物分析，PBP1～3与肽多糖转肽酶和葡萄糖转移酶活性有关；PBP4～6与羧肽酶活性有关。现已明确，PBPs实际上是有关粘肽合成的一类催化酶-青霉素敏感酶（penicillin sensitive enzymes）。PBPs数量极少，仅占细胞膜蛋白总量的1%，每个细胞只有20～30个分子。个别的PBPs性质已比较清楚，如PBP5为一种D，D-羧肽酶，分子量50000 U。通过一较短亲水肽（20～30个氨基酸）的羧基端嵌入在胞浆膜上，其氨基端和活性部位向外。每一种PBPs与β-内酰胺抗生素作用的详细机制仍不清楚。目前比较重视的是PBP1～3。因为PBP1与细胞快速裂解有关；PBP2和PBP3与细菌形态改变有关，这些都与LPS释放有关［13］。
不同的抗生素对不同的PBPs的亲和力不同，同种抗生素在不同的浓度下对PBPs的结合类型也不同。如：伊米配能在1～2倍MIC(最低抑菌浓度)时，优先与PBP2结合，使细菌成为渗透压稳定的大球形细胞，没有裂解；浓度大于5倍MIC时，与PBP1亲和力增加，导致迅速裂解。头孢他啶在低浓度时优先与PBP3结合，使细菌变成丝状；高浓度时也与PBP1结合，使细菌迅速裂解。初步认为其作用机理是，PBP1能控制细菌生长和菌体增大，是细菌生长的重要蛋白，主要功能为维持细胞形态，与抗生素结合可致细菌迅速裂解。PBP3能使细菌分裂停止，但不影响生长，故使细菌变成细长的丝状，其长度可达原体积的30倍。PBP2的作用机理尚不清楚，可能与维持细胞有关。在一项以头孢他啶（与PBP3结合）和伊米配能（与PBP2结合）的体外实验表明，头孢他啶引起的LPS释放量大于伊米配能10倍。对于这种现象，目前认为与PBP3的结合使细菌发生丝状变，生长没有停止，随着菌体的伸长LPS含量也不断增加，当PBP1受抑止致细菌裂解时，便释放出大量的LPS，其量明显高于与PBP2结合的伊米配能引起的球形变（因生长停止）。兼有上述两种变化的抗生素已在实验室中观察到，如美洛配能（meropenem）在浓度≤MIC时，与PBP3结合，引起丝状变，释放较多LPS，与头孢他啶相似；在浓度＞2倍MIC时，与PBP2结合，出现球形变，释放较少LPS，与伊米配能相似。但多数实验表明，美洛配能主要与PBP3结合。同时也证明，伊米配能引起的LPS释放及由此引起的TNF-α、IL-6等介质释放量均低于优先与PBP3结合的抗生素，如：头孢他啶、美洛配能、头孢三嗪等［14～17］。
三、LPS血症防治研究进展
抗生素的治疗，虽然能有效杀灭入侵的病原体，但随之而来的大量LPS释放给许多严重感染性疾病的救治，造成了极大困难，目前临床上尚缺乏有效地防治办法。尽管近年来已发现了许多新的拮抗剂，但多数仍停留在探索阶段。另外，随着对抗生素作用机制认识的加深，已经发现一些抗生素具有中和或减少LPS释放的能力。
1．免疫治疗：（1）单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）:这类抗体种类较多，主要为IgM和IgG两种，分别针对O-特异链、核心多糖和类脂A发挥作用。如：HA-1A、E5、McAb5B10、McAb8G9、McAb1B6、McAb3D10等。其中，较早应用于临床的HA-1A由于疗效差，存在严重不良副作用，因而已停用。E5（抗类脂A IgM抗体）临床应用显示了良好效果，能降低LPS和TNF-α，提高生存率。但对细胞结合型LPS无效。这是因为疏水的类脂A位于深部，受O-特异链遮蔽。但McAb1B6（Ig2A）能结合深部的类脂A。这些抗体通过中和LPS、促进单核细胞吞噬LPS及内在化作用发挥了良好的抗LPS作用。但这些抗体只能早期应用，过晚由于TNF-α已被激活释放，因而不能改善LPS引起的炎症反应［18］。(2)联合免疫:由于单克隆抗体仅针对LPS，不能对已产生的细胞因子起作用。因而采用多种McAb联合应用，比单一McAb更有效。Cross等［19］进行了由O-特异链McAb、J5多克隆抗血清和抗TNF-αMcAb组成的三联免疫动物实验。在没有用抗生素的情况下，单用任何一种制剂的生存率为25%～43%；任何2种制剂联合应用的生存率为50%～60%；3种制剂联合应用的生存率为77%。
2．重组LPS中和蛋白：重组LPS中和蛋白（recombinant endotoxin neutralizing protein，rENP）以鲎制取，对各种细菌的LPS均有高度亲和力。动物实验表明rENP能够显著降低抗生素治疗中的LPS和Gˉ细菌脓毒症的病死率，其疗效明显高于HA-1A［20］。
3．LPS拮抗剂:E5531为无毒性的红杆菌属外膜中的类脂A成分，已由实验室合成。E5531能竟争结合LPS受体，抑制LPS介导的细胞毒作用。动物实验表明，E5531与抗生素联合使用，能明显降低LPS的致死率［21］。
4．粒细胞抗菌蛋白:从多形核白细胞的嗜天青颗粒中，已分离出3种抗菌蛋白质：(1)杀菌性通透性增加蛋白（bactericidal permeability-increasing protein，BPI）；(2)抗菌15 Ku蛋白（antibacterial 15000 U protein isoforms，P15s）；(3)中性白细胞肽（nautrophil peptides，NPs）。BPI分子量55000 U，具有强大的杀菌、中和LPS和抑止TNF-α分泌的能力。P15s和NPs也具有一定的杀菌、中和LPS的能力，但对长链LPS（S型）无作用。3种蛋白经比较实验，证明它们的作用强度为：BPI远大于P15s，而后者与NPs相同。由于PBI的全部抗菌活性基团位于25000 u区域，因此已人工合成重组23000 U的BPI，即rBPI23。经临床实验证明，rBPI23能显著降低LPS、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10水平，减少了中性白细胞脱颗粒作用，因而抑制了LPS引起的生物效应。在4周的临床实验期中，任何受试者体内没有出现抗rBPI23抗体，肝、肾、骨髓功能无异常。除了部分受试者有短暂的皮肤潮红外，无其它任何副作用，应用前景十分良好［22］。
5．具有中和、减少LPS释放类抗生素：（1）多粘菌素B：由于其独特的化学结构，人们已发现多粘菌素B具有中和LPS的能力。许多实验已证明，该药单独或与其它抗生素联合应用，均能减少LPS的释放。但由于该药抗菌谱窄，有严重肾毒性副作用，因而限制了该药的应用范围。为此，人们已将多粘菌素B制成了复合制剂，如：多粘菌素B-右旋糖酐70、多粘菌素B-IgG等。该类复合制剂降低了肾毒性，仍保留了杀菌力和中和LPS的能力［23，24］。（2）新型β-内酰胺类抗生素许多体内外实验已经证实，凡与PBP2亲和力强的β-内酰胺类抗生素仅导致较低的LPS释放。已发现的这类抗生素有伊米配能、克拉维酸、氮卓脒青霉素、头孢诺米、头孢吡肟等。目前证明效果最好的是伊米配能。一项临床对照实验表明，LPS毒血症患者，经治疗4小时后，伊米配能（与PBP2结合）组的3例患者LPS水平已降低；头孢他啶（与PBP3结合）组的4例患者LPS水平没有降低，其中2例患者的LPS水平增加了。正在开发的新一代碳青霉烯类抗生素L-627（biapenem），不需与脱氢肽酶Ⅰ抑制剂联用，杀菌作用更强，副作用更轻，尤其对大肠杆菌PBP2、PBP4，绿脓杆菌PBP1a、PBP2、PBP4显示出强的亲和性。其特性明显优于第一代的伊米配能。而另2种已上市的碳青霉烯类抗生素美洛配能和帕尼配能（penipenem），主要与PBP3结合，无降低LPS的作用。选用优先与PBP2结合的抗生素，既能杀菌，又能减少LPS的释放，可以提高严重感染性疾病的救治水平［14，16，17，25，26］。
参考文献
1 Holzheimer RG. The significance of endotoxin release in experimental and clinical sepsis in surgical patients-evidene for antibiotic-induced endotoxin reliease ? Infection,1998, 26:77-84.
2 Bayston KF, Cohen J. Bacterial endotoxin and current concepts in the diagnosis and treatment of endotoxamia. J Med Microbiol, 1990,31:73-83.
3 Mitov IG, Terziiski DG. Immunoprophyiaxis and immunotherapy of gram-negative sepsis and shock with antibodies to core glycolipids and lipid A of bacterial lipopolysaccha rides. Infection, 1991, 19:383-390.
4 Haziot A, Chen S, Ferrero E, et al. The monocyte differentiation antigen, CD14, is anchored to the cell membrane by a phosphatidylinositol linkage. J Immunol ,1988,141:547-552.
5 Sherry B, Cermi A. Cachectin/tumor necrosis factor exerts endocrine, paracrine, and autocrine control of inflammatory responses. J Cell Biol, 1988,107: 1269-1277.
6 Norimatsu M, Morrison DC. Correlation of antibiotic-induced endotoxin release and cytokine production in Escherichia coli-inoculated mouse whole blood ex vivo. J Infect Dis, 1998,177:1302-1307.
7 Bucklin SE, Morrison DC.Differences in therapeutic efficacy among cell wall-active antibiotics in a mouse model of gram-negative sepsis. J Infect Dis,1995, 172:1519-1527.
8 Jackson JJ, Kroop H. Beta-lactam antibiotic-induced release of free endotoxin in vitro conparison of penicillin-biding protein (PBP) 2-specific imipenem and PBP-specific ceftazidim. J Infect Dis, 1992, 165:1033-1041.
9 Nitsche D, Schulze C, Oesser S, et al. Impact of different classes antimicrobial agents on plasma endotoxin activity. Arch Surg, 1996,131:192-199.
10 Trautmann M, Zick R, Rukavina T, et al. Antibiotic-induced release of endotoxin:in-vitro comparison of meropenem and other antibiotics. J Antimicrob Chemother, 1998,41:163-169.
11 Evans ME, Pollack M. Effect of antibiotic class and concentration on the release of lipopolysaccharide from Escherichia coli. J Infect Dis, 1993, 167:1336-1343.
12 Jaber BL,Barrett TW, Cendoroglo-Neto M, et al. Endotoxin removal by polymyxin-B immobilized polystyrene-derivative fibers during in vitro hemoperfusion of 10% human plasma. ASIO, 1998,44:54-61.
13 周坚芬.青霉素结合蛋白研究进展.国外
14 Prins JM, Agtmael MA, Kuijper EJ, et al. Antibiotic-induced endotoxin release in patients with gram-negative urosepsis: a duoble-blind study comparing imipenem and ceftazidim. J Infect Dis, 1995, 172:886-891.
15 Lundblad R,Giercksty KE.Synergistic effect of E5,imipenem and volume support during fulminant intraabdominal sepsis in rats.J Infect Dis,1995,172:152-160.
16 Takahashi K, Narita K, Kato Y , et al. Low-level release of Shiga-like toxin (vero-cytotoxin) and endotoxin from enterohemorrhagic Escherichia coli treated with imipenem. Antimicrob Agents Chemother, 1997 ,41:2295-2296.
17 Arditi M, Zhou J. Differential antibiotic-induced endotoxin release and interleukin-6 production by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) : amplification of the response by coincubation of HUVECs and blood cells . J Infect Dis,1997,175:1255-1258.
18 Hoffman WD, Pollack M, Banks SM, et al. Distinct functional activities in canine septic shock of monoclonal antibodies specific for the O-polysaccharide and core regions of escherichia coli lipopolysaccharide . J Infect Dis,1994,169:533-561.
19 Cross AS, Opal SM, Palardy JE, et al. The efficacy of comination immunotherapy in experimental pseudomonas sepsis. J Infect Dis,1993,167:112-118.
20 Saladino RA, Stack AM , Thompson C, et al. High-dose recombinant endotoxin neutralizing protein improves survival in rabbits with Escherichia coli sepsis . Crit Care Med,1996,24:1203-1207.
21 Christ WJ, Asano O, Robidoux AL,et al. E5531,a pure endotoxin antagonist of high potency . Science, 1995,268:80-83.
22 Marijke AM, ronder MA, Kimmings N, et al. Inhibition of endotoxin-induced cytokine release and neurtrophil activation in humans by use of recombinant Bacterici/dal/Permeability-Increasing Protein. J Infect Dis, 1995,172:144-151.
23 Bucklin SE, Lake P, Logdberg L, et al.Therapeutic efficacy of a polymyxin B-dextran 70 conjugate in experimental model of endotoxemia. Antimicrob Agents Chemother,1995,39:1462-1466.
24 Drabick JJ, Bhattacharjee AK, Hoover DL, et al. Covalent polymyxin B conjugate with human immunoglobulin G as an antiendotoxin reagent. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42:583-588.
25 许铁男,编译.碳青霉烯类抗生素L-627.药学进展，1994,18：227-230.
26 Chen HY, Livermore DM. In vitro activity of biapenem, compared with imipenem and meropenem, against pseudomonas aeruginosa strains and mutants with known resistance mechanisms. J Antimcro Chemother, 1994,33:949-958.
（收稿 ：1998-02-25 修回：1998-09-16）
