细胞培养知识和技术

康宁/Corning® 淋巴细胞无血清培养基

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1、细胞（组织）培养年鉴

1878 Claude Bernard:证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。

1885 Wilhelm Roux:在一个生理溶液中维持一快鸡胚的活性并观察其发育，从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。

1887 Ross Harrison:利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了神经纤维的生长，从解决了神经纤维的来源问题。Ross Harrison被人称为细胞培养之父。

1910 Burrows:率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.

1911 Lewis & Lewis:由海水、血清、胚胎提取物和盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液，并观察到了单层细胞的有限生长。

1916 Rous & Jones:开创使用胰酶来收获贴壁生长的细胞。

1923-1931 Carrel & Baker:研制T型培养瓶大规模培养细胞。

1927 Carrel & Rivera:制造了第一个病毒疫苗：牛痘疫苗。

1933 Gey: 发明了转管培养细胞的技术。

1948 Fisher: 研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006，该培养液至今还在使用。

1952 Gey 和同事：分离培养了Hela细胞。

1952 Dulbecco:发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。

1954 Abercrombie: 观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。

1961 Hatflick & Moorhead：显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。

1965 Ham:配制了第一个无血清培养液。

1975 Kohler & Miltein:成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。

2、怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件？

ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数常用细胞的详细资料。

打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。

数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，显微形态以及相关文献等资料。

3、为什么大多数细胞培养需要用二氧化碳培养箱?

一般细胞培养液的pH在7.0-7.4之间。由于碳酸盐pH缓冲系统是一种生理pH缓冲系统（它是人体血液中最重要的pH缓冲系统），所以大多数培养液用它来保持稳定的pH。用粉末配制培养液时，常常需要加入一定量的碳酸氢钠。

对大多数以碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的pH，培养箱中的二氧化碳需要维持在2-10%之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。

是不是采用其他pH缓冲系统就不需要二氧化碳培养箱了呢？人们发现由于空气中的二氧化碳浓度很低，如果细胞不在二氧化碳培养箱中培养，培养液中的HCO3-会被耗尽，这样会影响细胞的正常生长。所以大部分动物细胞的培养，还是需要二氧化碳培养箱。

细胞培养液中常附加其他的pH缓冲系统，比如HEPES缓冲系统，来增加pH缓冲能力。HEPES在pH7.2-7.4之间有很强的缓冲能力，当透气的培养器皿被拿到二氧化碳培养箱外面的时候，由于空气中二氧化碳浓度很低，培养液中碳酸盐缓冲系统就会失去效果，这时候HEPES缓冲系统就能继续保持pH的稳定。

4、二氧化碳培养箱的挑选和使用

由于动物细胞培养液一般使用碳酸盐pH缓冲系统，要求培养环境中维持一定浓度的CO2，所以动物细胞的培养一般需要CO2培养箱。

CO2培养箱采用两种不同的CO2维持系统。一种方式是通过使用空气泵，将CO2和空气按一定比例混合后吹入培养箱。另一种方式是通过一个自动的CO2检测控制系统，在检测到CO2浓度低于要求浓度时打开CO2气阀充入CO2。由于前一种方法耗费CO2而且不容易精确控制CO2浓度，先进的CO2培养箱都采用自动监控系统来维持CO2的浓度。

配有自动CO2检测控制系统的培养箱需要根据生产厂家的说明，定期做CO2浓度的测试和矫正，防止因为零点漂移而导致CO2显示浓度和实际浓度不一致。

CO2培养箱的隔热采用水套式和气套式两种类型。水套式需要用户在安装培养箱时培养箱壁的空间内灌入大量蒸馏水。由于水的比热容很高，水套式的优点是有助于均匀散热和避免形成冷区，以及在断电后能够比较好的减缓培养箱内温度的降低。它的缺点是由于灌入大量的水，培养箱变得非常沉重，不易搬动。有效的隔热系统和先进的表面散热元件的使用使气套式培养箱兼备了轻便性和水套式培养箱的优点，所以新型的CO2培养箱大多采用气套式。

目前大多数实验室都使用进口的细胞培养箱。虽然进口的产品质量上比较有保障，但价格很贵，而且售后服务不是很方便。国内的细胞培养箱的质量也有了很大的提高，价格低，售后服务也比较方便（笔者目前使用的二氧化碳培养箱是长沙长锦科技的，质量和售后服务都不错）。

CO2培养箱一般配一个水盘，用以维持很高的湿度。水盘内的水要定期添加，水盘也要定期清洗以避免微生物的生长。

为了减少微生物的污染，有一些CO2培养箱提供灭菌功能。有的可以加热到比较高的温度来灭菌，有的则通过让空气循环通过一个紫外线腔体的办法来灭菌，这样就灭菌时就不需要中断细胞的培养。

5、超净台的挑选和使用

为了避免污染，一般的细胞培养需要在超净台上进行。用于细胞培养的超净台的洁净度一般为100级，即每立方英尺中大于0.5um的颗粒数量少于100颗，与计算机硬盘的生产环境要求相当。

在超净台内，过滤后的空气垂直由上到下，或水平由内到外稳定的流动，从而维持一个洁净的操作环境。根据气流的方向，超净台可分为垂直式层流和水平式层流两种类型。

在水平式层流型超净台内，过滤后的空气由内到外流动，在操作过程中比垂直式层流型更容易维持一个洁净的环境，减少污染的机会。但是由于气流吹向实验操作者，增加了实验操作者感染病原体的机会，所以大部分实验室都采用垂直式层流型的超净台。

在普通的垂直式层流型的超净台内，过滤后的空气自上往下流动，通过操作面板前后两排开孔直接排出。这样的超净台比较便宜，但是不适合病原体相关的实验操作。相关病原体的操作必须要在生物安全柜内进行。在生物安全柜内，自上而下的过滤后的空气经过超净台，然后再次过滤后，才被排到外面，从而大大减少了病原体扩散的机会。当然生物安全柜比较贵，但考虑到培养的细胞中以及血清中都有可能有病毒等病原体的存在，有条件的实验室应该尽量使用生物安全柜来进行细胞培养。

超净台需要定期检查，超净台的空气过滤系统也需要定期更换，以保证超净台内的洁净度。空气过滤系统的更换次数可以询问生产厂家。如果有洁净度检测设备的话，可以非常迅速的检验超净台的洁净度。如果怀疑细胞培养过程中的污染是由于超净台内洁净度降低引起的，可以用将一个含微生物培养基的培养皿在超净台内敞口放置一段时间，然后在37℃培养的方法来评估。

超净台内一般都有紫外线灯用于灭菌。紫外线灯的正确使用方法是在超净台使用前打开半小时左右。有的操作人员在不使用超净台的时候把紫外线灯一直打开，这样不但没有必要，而且会大大缩短紫外线灯的使用寿命。紫外线灯要根据生产厂家的说明定期更换。

超净台使用完之后要先用蒸馏水擦拭，然后再用70%酒精擦拭。直接用70%酒精擦拭溅在台面上的培养液会在不锈钢台面上留下难以去除的污渍。

6、为什么培养的细胞要及时传代？

体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长。当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的对接触抑制不敏感的细胞会继续生长。如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞。

7、细胞培养中流行的错误（过时）知识

（1）血清一定需要加热灭活

人们通常通过在56°C加热30分钟的办法，来灭活血清中的补体，以及其中可能的微生物（比如支原体）的污染。加热灭活带来的问题是，血清中的氨基酸、维生素和生长因子等也会不同程度的被破坏。

Triglia and Linscott 的研究发现（1），胎牛血清中的补体含量很低，即使在未稀释的胎牛血清中，也观察不到溶血现象。另外37°C的加热能够有效灭活补体。所以对胎牛血清而言，并不需要通过专门的热灭活来灭活其中的补体。

早期的血清制备中的滤膜的孔径大于0.22um，不能有效的去除支原体的污染。热灭活可以去除支原体的污染。但是现在血清制备中的终端滤膜的孔径为0.1um甚至小到0.04um，所以血清中一般没有支原体的污染。

综合上面的观点，除非有特别的情况，标准厂家生产的胎牛血清一般不需要加热灭活。

需要说明的是，有些厂家生产的胎牛血清质量并不符合标准。所以如果您的胎牛血清来自一家可信度不高的厂家，那么为了安全起见，还是以加热灭活为好。

（2）培养液中一定要加抗生素

随着超净台技术的提高，和超净台在细胞培养中的广泛使用，在细胞培养过程中如果操作规范，引进污染的机会并不大。同时抗生素的使用大大增加了支原体等微生物污染的机会，所以普通的细胞培养，最好不要加抗生素。

（3）细胞培养室要异常的洁净

由于以前超净台技术比较差，在超净台开启的时候，外面的灰尘可能飘到超净台里，笔者曾经见过的一个老式的没有空气过滤装置超净台，仅使用紫外线灯灭菌，这样实验室的清洁就显得很重要。现代的超净台从原理上来说，超净台外的污染源是很难到达超净台里面的(见文章5：超净台的挑选和使用)。所以保持细胞培养室一定程度的清洁固然有助于减少污染的机会，但是过度的清洁，比如用0.2%新洁尔灭拖地板，或者在培养室内加紫外线灯消毒，并不需要，更重要的是实验操作的规范。笔者曾经工作过的一个细胞培养室，维护实验室清洁的工作就是每天拖一次地板，每天大家进出并不换鞋换衣服，在2年多的时间内从没有发生过任何污染。

（4）在超净台上使用酒精灯

事实上使用酒精灯会造成空气对流，从而带起超净台面上的灰尘，反而增加污染的机会。更何况还增加了火灾的隐患。

[1]Triglia, R.P., Linscott, W.D. 1980. Titers of nine complement components, conglutinin and C3b inactivator in adult and fetal bovine sera. Molecular Immunology. 17:741-748.

8、一次性细胞培养皿等标明 “Tissue Culture Treated”是什么意思？

大部分动物细胞需要贴附在一个固相界面上才能生长。而一般只有亲水的固相界面，细胞才能贴附。

最早的细胞培养器皿是由玻璃制作的。由于玻璃的表面是亲水的，不经过特殊的处理，普通的细胞就可以贴附生长。

聚苯乙烯透光性能好，具有较好的强度和易塑性，并且没有毒性，成为一次性细胞培养皿和培养板等一次性细胞培养耗材的首选材料（一般的磁带和CD盒也是用聚苯乙烯制成的）。然而聚苯乙烯表面是憎水的，所以需要经过表面的改性处理，变成亲水后才能适用于细胞培养。

一次性细胞培养皿等标明“Tissue culture treated”，是表示该器皿经过表面的改性处理，适合贴壁细胞的培养。而悬浮生长的细胞，就不一定需要这样经过特殊处理过的器皿。但经过表面的改性处理后的细胞培养皿等一般也适合悬浮细胞的培养。

9、细胞培养中边缘效应和解决办法

在使用多孔板的细胞培养中，周边孔的细胞生长情况和实验数据常常和其他孔有系统误差，这种现象统称为边缘效应。在很多大规模药物筛选实验中，人们甚至弃去周围孔，不用于实验。

引起边缘效应的原因有多种，其中最常见的也容易明白的是周边孔水份挥发比其他孔多而导致的系统误差，这在四个角上的孔中尤其明显。对于这个问题目前没有根本的解决办法。不过可以采用少开培养箱从而保持培养箱中的湿度等办法来减轻。

另外一个不容易解释的边缘效应是，在周边孔中的细胞会集中在孔的外侧，如下图所示（孔内白亮的为细胞集中的区域）。这种现象在实验中常用的96孔板中十分明显。由于大多细胞的生长会受周围接触细胞的抑制，所以这种边缘效应导致边缘孔内细胞平均生长速度要比其他孔来得慢，从而在实验过程中引入系统误差。这种边缘效应是由于在室温下的培养板转移到37℃培养箱后，培养板上产生的温度差影响细胞沉降引起的。所以这种解决边缘效应的一个简单有效的方法，就是在培养板内分入细胞后，在室温下放置1-2个小时，让细胞在没有温度差的情况下沉降并贴附，然后再转移到37℃培养箱内[1]。该方法至少适合CHO等在室温下能贴壁的细胞。

[1]BETINA KERSTIN LUNDHOLT, KURT M. SCUDDER, and LEN PAGLIARO, A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays. Journal of Biomolecular Screening 2003:566-570

10、细胞培养液简介

虽然细胞培养的实验早在19世纪末就开始了，但用于培养细胞的培养液主要是动物的血清或淋巴液。被人称为细胞培养之父的Ross Harrison就是利用青蛙的淋巴液来培养神经细胞的。这样的培养液不但性质不稳定，而且只能进行非常小规模的细胞培养。

第一个人工配制的培养液是由Lewis & Lewis在1911年由海水、血清、胚胎提取物和盐和蛋白胨为原料配制成的。但是人们对于培养液中的化学成分并不清楚。直到1948年，Fisher才研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006。

实验室常用的细胞培养液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、无机盐、维生素和微量元素等。为了维持稳定的pH，培养液中一般有一个pH缓冲系统，同时常加入少量的酚红作为pH指示剂。另外培养液中一般需要加入一定量的血清。

培养液中的氨基酸除了13种细胞生长所必须的氨基酸外，往往加入一些非必需的氨基酸以促进细胞的生长。在必需的氨基酸中，L-谷氨酰胺在溶液中不稳定（在4℃培养溶液中半衰期为3个星期，37℃中为1个星期），需要在使用时加入。

葡萄糖在培养液中的含量一般为1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。它是细胞代谢重要的能量来源。

细胞培养液中都有一个平衡盐系统，用于维持细胞的渗透压、维持pH和细胞正常的代谢等。最常用的平衡盐系统有Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS); Earle's balanced salts (EBSS) 和 Hanks' balanced salts (HBSS)。它们都含有细胞所必需的5种离子：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子和磷酸根。培养液中的pH缓冲系统一般是碳酸氢钠和HEPES等。

培养液中的维生素包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等。培养液中的微量元素元素包括Cu2+ ，Zn2+ ，和Mn2+等。

血清中含有生长因子、促进细胞帖壁的因子、矿物质、激素、脂类等，另外血清可以抑制胰酶的活性。

一般培养液都含酚红作为pH指示剂，它是细胞培养液状态的一个很好的标志。过长时间的培养或者微生物的污染都会使培养液的pH发生改变。需要注意的是，酚红可以模拟类固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培养的细胞对雌性激素敏感（比如实验本身就是研究雌性激素对细胞的作用），就应当使用没有酚红的培养液。

11、选用血清时要注意什么？

细胞培养使用的一般是胎牛血清。由于胎牛血清价格非常贵，为了节约，对于一些比较容易生长的细胞，有时候也使用新生牛血清，或者马血清。

血清中含有血清清蛋白、生长因子等。对于大多数培养的动物细胞而言，培养液中加入血清是生长必须的。虽然无血清培养液已经出现，但无血清培养液只适用于特定的细胞，而且价格一般比较昂贵，所以在比较长的时间内，细胞培养仍然需要血清。

对于一种特定的细胞，可以从ATCC（American Type Culture Collection）查到培养液中需要加入的血清的种类和浓度。

来自不同商家的血清差异很大，即使来自同一商家的血清，不同批次之间仍然会有非常大的差异。对于培养不易生长的细胞而言，挑选优质的血清非常重要。一般来说，可以向血清生产商家索取少量不同批次的血清，经过试验后找到对细胞生长最有利的批次，然后大量购买该批次的血清，储存于-80度的冰箱内，供长期使用。

12、细胞培养过程中有哪些污染？

细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。

化学污染

化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。

化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。

生物污染

生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染，和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。

细菌、霉菌和酵母到处存在，它们能在合适的环境中非常快速的生长。这些污染比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化，或者通过显微镜观察就可以看见。

由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。

1956 年 Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。90年代初的一个调查发现，在美国培养的细胞中，至少有15%被支原体污染。由于支原体没有细胞壁，在细胞培养液中几乎是透明的，同时对常用于细胞培养中的抗生素不敏感，不引起 pH 变化，不使培养液浑浊，所以支原体污染不容易被发现，但是其存在会影响实验的结果。

培养多种细胞时操作不当，会导致细胞的交叉污染。由于不同细胞的生产速率不同，污染的生长速率快的细胞最终会完全取代被污染的细胞。

13、怎么样才能减少污染的机会？

减少化学污染

对于自己用粉末配制培养液的实验室来说，配制培养液要使用重蒸馏水，以减少带入化学污染的机会。如果要添加NaHCO3，要选用纯度高的NaHCO3，最好是经过细胞培养测试的。

另外尽量使用一次性的细胞培养器皿。由于标准厂家一次性细胞培养器皿的生产环境比较严格，得到的产品洁净度很高，从而减少了由细胞培养器皿带入污染的机会。

减少生物污染

由于一般的污染发生在细胞培养的操作过程中，所以良好的细胞培养操作环境和操作习惯是减少生物污染的关键。

要用一个专门的房间用于细胞培养，注意保持房间的清洁。

要有一个定期检验的合格的超净台（超净台内的洁净度应该为100级，与计算机硬盘的生产环境相当）。在使用超净台前开启通风装置并打开紫外灯灭菌30分钟。操作时要戴一次性橡胶手套，并喷洒70%酒精消毒。任何带入超净台的非无菌物件都要喷洒70%酒精消毒。收集废培养液的瓶子要加入漂白粉或漂白液，以避免微生物的生长。每次实验完后，要向通向废培养液瓶的塑料管内喷洒70%酒精，并且用蒸馏水和70%酒精先后擦拭台面（只用70%酒精擦拭会导致洒落在台面的培养液在台面上形成难以清除的污垢）。

不要在超净台里使用酒精灯等灯具，因为这样会因灯的热的火焰引起的空气对流而破坏超净台里本来规则的空气层流，使本来存在于超净台底层的微粒被带到上层，带来更多的污染机会。

加热培养液的37°C恒温水浴中非常容易有微生物的生长，从而成为一个重要的污染源。所以需要定期清洗恒温水浴。细胞培养箱内的用于保持湿度的水盘也需要定期清洗。为了减少不同细胞株间的相互污染，不要用同一瓶培养液或胰酶培养不同的细胞；不要在一个超净台上同时进行多种细胞的操作。分装每次小量使用的溶液（如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液），以减少多次使用时污染的机会。

以防万一

即使再小心，污染难免还是会发生。所以得到一个新的细胞株后的第一件事情，是把细胞生长扩增后冻存起来，以备不测。何况一般的细胞在传代次数多了以后，遗传特性也会发生改变。通过批量冻存的办法，可以有效的把培养的细胞控制在一定的代数以内。

14、内毒素是什么？

内毒素的化学成分是脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组分之一。一个活的细菌很少释放内毒素，但死后可放出大量内毒素。

内毒素在血液中存在时会引起动物发热，是医疗注射液中最主要的热原。19 世纪 40 年代开始用注射溶液引起兔的发热反应实验来检测热原（主要是细菌内毒素）。后来研究者发现鲎（一种海洋生物）血液遇到极微量的内毒素会发生凝血反应，从而在19 世纪 70 年代发明了鲎试剂用于快速精确检测内毒素。内毒素含量一般用国际单位（ EU ）来衡量，一般来说 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。

由于内毒素会对很多种细胞产生刺激，影响实验结果，所以在实验中要尽量减少在培养液中的内毒素的来源。

由于生产工艺的提高，来自标准厂家的血清和培养液中的内毒素含量很少。所以现代实验室细胞培养中内毒素的来源主要是水、添加剂、细胞培养器皿等。传统的玻璃仪器制备的双蒸水和通过离子交换柱、活性炭柱和超滤三个环节的纯水制备仪制备的超纯水都能满足细胞培养用水的要求。盛水器具上的细菌内毒素可能给超纯水带来污染。长时间放置的超纯水也可因盛水器具上细菌生长而污染细菌内毒素。

内毒素能紧密的粘在玻璃器皿上，实验室里用普通的方法不能完全的消除除内毒素。用 250 ℃， 30 分钟或 180 ℃， 2 小时干热灭菌能完全除掉玻璃器皿上的内毒素。

一次性塑料器皿经过高温注塑成型，没有内毒素存在。但在处理、包装等生产过程中，可能污染内毒素。杭州生友生物技术有限公司生产的一次性细胞培养皿和培养板等在万级无尘车间生产和包装，产品的内毒素含量低于 0.5EU/ml。

15、细胞的冻存

一个实验室得到一个新的细胞株后，首先要把该细胞株培养扩增后冻存起来。细胞冻存首先可以在由于污染等情况丢失细胞时有备份可用，另外几乎所有细胞在培养传代的过程中发生一定程度的变异，为了保持实验结果的一致，一般细胞在培养几十代以后就不能再使用了，需要将冻存的，传代较少的细胞化冻培养再使用。

细胞冷冻过程有四个要点：细胞的收获、保护剂的使用、冷冻速率和储存环境。

细胞的收获

用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。收获用来冻存的细胞开始时方法和平时一样，用 100xg 离心 5 分钟收集细胞再重悬，活细胞记数。稀释或浓缩到细胞保存的最终细胞浓度的二倍（一般是 400-1000 万细胞 /ml ），加入已经配好的等体积的培养液保护剂混合溶液中轻轻混匀，分装到冻存管，冷冻保存。

保护剂的使用

细胞冻存中，一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。对特别敏感的细胞特别是杂交瘤细胞在冻存时使用 95% 血清和 5%DMSO 可能会好些。保护剂在使用时先用培养液或血清配成最终浓度的 2 倍，再与等体积的悬浮细胞的培养液混合。

细胞冻存的速率

细胞的冷冻速率最是控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。通常的操作是把细胞先在-20℃1-2个小时，再放入 -80℃冰箱过夜（如果没有-80℃冰箱，可以用干冰替代），再转入液氮罐或低于 -130℃的冰箱长期保存。

另外一个办法是，在-20℃1-2个小时以后，把冷冻管悬掉在液氮罐的气相中，以控制冷却的速率。这个方法比较简单，因为细胞也可以在液氮罐的气态中长期保留，所以不用计时。对于没有-80℃冰箱，或者购买干冰不方便的人来说，这是一个比较好的办法。

储存环境

细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能最好保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸（但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加）。细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。

16、怎样化冻动物细胞？

化冻过程的原则是要让冻存的细胞快速融化。

如果细胞储存在液氮液面下，使用者最好准备好必要的防护器具（至少要戴上护目镜，最好戴上面罩和较厚的手套），防止进入冻存管的液氮骤然膨胀引起爆炸而造成伤害(笔者曾经在化冻的时候，为了防止污染，把冷冻管放到一个15ml离心管中，而且把盖子拧上了，打算放到 37℃水浴，恰好回过头去和别人谈话，忽然听到一声爆炸声，回头一看，15ml的离心管就剩下盖子了，其他的都爆飞了)。从冰箱或液氮罐取出细胞后将冻存管放 37℃水浴轻轻晃动使之化冻完全，注意不要让水浸到盖子以防污染发生。

由于大多防冻剂与细胞长时间接触时对细胞有毒害，所以最好尽快除去细胞冻存时加入的防冻剂。

防冻剂的去除方式和细胞的敏感性有关。有些细胞在某些防冻剂存在的条件下能很好的贴壁生长，可以直接将化冻的冻存细胞连同其冻存液加入预备好 15-20ml 培养液的细胞培养瓶或培养皿中，轻轻混匀后放入培养箱培养过夜后换培养液。

对于敏感细胞要加入 10ml 培养液中， 100xg 离心 5 分，去上清后加培养液轻轻重悬细胞，加入培养器皿后在培养箱培养，第二天更换培养液。