一、限制性内切酶酶切注意事项

在进行限制性酶切反应过程中,影响限制性酶切反应效果的因素较多,要设计酶切反应,一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件,酶切反应的设计一般应注意以下问题：

1. 大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12%时,某些限制酶的识别特异性降低,从而产生星活性,更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释,但切勿用水稀释以免酶失活,用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子,当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时,酶活性会被抑制,或改变酶的特异性,导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大,小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散,并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反应所加入的酶量应适中,根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定,对不同的限制酶,各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时,如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好,则两种酶可同时切割,如果这些酶所要求的缓冲液有所不同,则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA,然后加入适量NaCl及第二种酶,继续反应；②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

8. 用同一种酶切割不同的DNA时,所需酶量不同,可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA存在位点的数目比较后,决定用酶量。对于超螺旋DNA,基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA,使用的酶单位活性应适当加大。

9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA,可维持酶的稳定性。

10.酶切底物DNA应具备一定的纯度,其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚,大于10mM的EDTA,去污剂SDS以及过量的盐离子浓度,否则会不同程度地影响限制酶的活性。

11.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素,所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。

12.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量,酶反应才能有效地进行。

13.反应取酶时应使用无菌吸头,以免污染酶液,同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。

14.高于37℃或需长时间保温时,可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。

15.反应混合物混匀时,应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。

16.反应前的低速离心是必要的,这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。

17.用已硅化的离心管进行酶切反应,可获得更佳的酶切效果,否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。

18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法：①酶切后不需进行下一步反应,可加入含EDTA的终止液终止反应；②若需进一步反应(如连接,切割等),可将反应管置65℃保温20-30分钟,以灭活酶终止反应。③可用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。

19. 不同厂家的试剂不可混用,需要时请查明相关条件及数据。

二、限制性酶解中常见的问题及解决措施

限制性酶切割DNA底物的操作过程中,会出现一些问题,产生的原因主要为酶解体系中各要素处于非最佳状态,包括DNA的纯度和特性,反应缓冲液、反应体积、反应时间及温度等。

问题 原因 解决办法

 DNA完全没有被内切酶切割 1) 内切酶失活 标准底物检测酶活性 2) DNA不纯,含有SDS,酚,EDTA等内切酶抑制因子 将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA 3) 条件不适(试剂、温度) 检查反应系统是否最佳 4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株 5) DNA酶切位点上没有甲基化(如Dpn I) 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA(如San3A I代替Dpn I),重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 6) DNA位点上存在其它修饰 将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证 7) DNA不存在该酶识别顺序 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证

DNA切割不完全 1) 内切酶活性下降 用5-10倍量过量消化 2) 内切酶稀释不正确 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3) DNA不纯,反应条件不佳 同上 4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 同上 5) 部分DNA溶液粘在管壁上 反应前离心数秒 6) 内切酶溶液粘度大,取样不准 将内切酶稀释,增大取样体积 7) 酶切后DNA粘末端退火 电泳前将样品置65℃保温5-10分钟,取出后置冰浴骤冷 8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 使用标准反应缓冲液及温度,避免强烈振荡 9) 过度稀释使酶活性降低 适当稀释酶液,反应液稀释的酶不能贮藏 10)反应条件不适 使用最佳反应体系 11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 加大酶量5-10倍

DNA片段数目多于理伦值 1) 内切酶星状活性 检查反应条件：甘油浓度大于12%,盐度过低,Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性,降低酶的用量 2) 其它内切酶污染 用λDNA作底物检查酶切结果 3) 底物中含其它DNA杂质 电泳检查DNA,换用其它酶切,纯化DNA片段 酶切后没有观察到DNA片段的存在 1) DNA定量错误(如RNA含量较高) 用RNA酶A(无DNA酶)100ug/ml消化DNA样,酚抽提后沉淀溶解,定量 2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀 在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次

内切酶保存期内快速失活 1) 保存温度不合适 内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中,应在-20℃低温保存 2) 以稀释形式保存 稀释酶液不宜长期存放,应一次使用 3) 贮藏缓冲液不适当 使用厂家推荐的贮藏缓冲液 4) 低蛋白浓度 内切酶与500ug/ml的BSA一起保存 电泳后DNA片段的带型弥散,不均一 1) DNA上结合有蛋白质 电泳前上样液65℃加热5min,并加入0.1%的SDS,酚/氯仿抽提纯化 2) 内切酶中含有DNA外切酶 减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶

酶切后的DNA片段连接效率低 1) 含磷酸盐的浓度高 透析,乙醇沉淀去除磷酸盐 2) 内切酶失活不全或含有ATP酶 延长灭活时间或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA 3) 平末端连接 加大T4 DNA Ligase用量 4) 外切酶污染 减少酶用量,缩短保温时间,酚抽提回收DNA 5) 连接缓冲液不合适 重新配制连接缓冲液

三、DNA分子量标准问题分析

问题 原因 解决办法

带弱或无DNA带 1) 上样DNA的量不够 增加DNA的上样量,聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高 2) DNA降解 避免DNA的核酸酶污染 3) DNA走出凝胶 减短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度 4) 对于EB染色的DNA,所用紫外光源不合适 应用短波长(254nm),紫外灯增强灵敏度

DNA带缺失 1) 小DNA带走出凝胶 减短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度 2) 分子大小相近的DNA带不易分辨 增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度 3) DNA 变性 电泳前请勿高温加热DNA链,以20mM NaCl Buffer稀释DNA 4) 巨大DNA链,凝胶电泳不合适 在脉冲电声凝胶电泳上分析

 DNA带模糊 1) DNA降解 避免核酸酶污染 2) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量 3) 所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃,巨大DNA链,温度应<15℃,核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 4) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 5) 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白 6) DNA变性 电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA

不规则DNA带迁移 1) 对于λ/Hind III片段COS位点复性 电泳前加热DNA 65℃加热5-10分钟,然后在冰上冷却5分钟 2) 电泳条件不合适 电泳电压不超过20V/cm,温度<30℃,电泳缓冲液有足够的缓冲能力 3) DNA变性 以20mM NaCl Buffer稀释DNA,电泳前勿加热 以λ/Hind III为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准,会发现电泳后分子量条带不对的问题,解释原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点,COS位点的退火复性,在λDNA片段电泳分离时会出现问题,含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到,而复性的左右臂片段会结合成大的片段,即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带,这就造成了不正常的带型。解决以上问题的办法,是在电泳之前,把DNA分子量标准67℃加热约10分钟,然后立即放入冰浴中骤冷,待样品冷却后上样。这样即可解离复性的粘性末端,使电泳过程DNA片段形成正常的带型分布。

四、凝胶电泳操作注意事项

1. 缓冲系统：在没有离子存在时,电导率最小,DNA不迁移,或迁移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很高并产热,可能导致DNA变性,因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。

2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。

3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。

4. 样品加入量：一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。

5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判定是必要的。

6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。

7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

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