PCR技术应用三：突变基因检测

基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础，结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途径，并取得了令人瞩目的成果.

　　基因突变是癌基因激活，抗癌基因失活及遗传病发生的根本原因，从广义的角度来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它仍所涉及的范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常的涉及的范围较少，它是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因分析的主要研究内容.不同类型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。

PCR在突变基因检测时的应用

　　利用核酸探针及Southern印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满足这际工作的需要，自从PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织亦可经PCR扩增而进行中种检测，加上PCR技术与探针杂交技术，RFLP技术及PCR直接测序的结合，改换方法得以迅速发展和推广，大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因的研究进展.

一、点突变的PCR直接检出

(一)用PCR直接检测缺失:

　　当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物，然后进行PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外检测仪下检测有无特异性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无DNA片段的缺失.

　　1.一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚，其缺失部位亦较为固定，即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR，然后琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际应用中，为了避光因某些原因引起的扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应用PCR技术进行X地贫Bartα基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时，常用一对引物扩增缺失区域，同时同一对β基因引物扩增β基因的一个片段，然后电泳检测.若同时即有α和β基因的特异性扩增产物，则说明α基因的扩增产物则说明模板DNA中有α 基因的缺失，为Bart胎儿水肿综合征.

　　2.多对引物的多重PCR检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质性，即在不同患者其缺失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一PCR体系扩增多个外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如，则可判定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行的检测途径，目前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在DMD/BMD缺失型突变的检测中，用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出，另外还有人用9对物进行两组多重PCR，大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突变.

　　3.用PCR技术进行杂合性丢失的检测：有报道，PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检测.

(二)单个碱量置换的PCR直接检出

　　1.直接检测限制性内切酶切点的变化-PCR产物酶解分析

　　PCR产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变--包括所增加的酶切位点及原有的酶切点消失的单碱是量置换性点突变.当某一点突变引起DNA片段中酶切位点发生改变时，则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段，然后用相应的内切酶进行处理，电泳检测，与正常的无改变的段进行对片分析即可确定有无酶切位点的改变.比如状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变的改，正常情况下靶DNA 的扩增产物为294bp，经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段，但镰状细胞贫血的突变使该切点消失，OxaNI消化后仍为294bp的片段，而杂合子则是有294、191和103 三个片段。用引方法检测突变快速可简便，但必须在突变点涉及到限制性内切酶切关并引起进次复时不能因此方法检测，因此其应用受到限制，反能检出点突变的极少一部分.

　　2.3'特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.

　　以上三种方法结构是基于以下机理，只是不同作者的采用的名河差别而异.

　　在PCR扩增时，引物的延伸是从其3'未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3'端的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期的扩增产物，若引物3'端与模板不能配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的扩增产物，基于以上事实，可利用3'端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的突变位点，此即3'特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.该反应系统包含两个 PCR扩增反应，有两对引物但它们的3'端有差异，一为正常引物，另一为3'端编食突变的引物，正常引物只与正常模板互解，PCR时扩增相应的产物，而食突变的引物只与突变的模板附扩增出相应的产物.扩增完成后可直接同琼脂糖电泳技术检测分析结果。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个体，在这种情况下，同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应. 尚可利用多对突变引物和正常引物进行多重3'-特异PCR，可攻DNA分子上的多位点变化的鉴定准确快速，简便。

　　3.PCR直接测序

　　DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部队，而且还可确定突变的性质.PCR直接测序是指对PCR产物进行的直接序列分析，而不是家传的测序技术先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这不仅大大的简化了操用步骤，节省大量的人力和物力，而且可实现自动化操用，加之新的荧光检测技术的应用，使测序的效率大大提高.

　　采用PCR循环直接测序时，应首先将扩增产物转化为单链测序模板，目前常用的转化方法为不对称PCR，即在反应体系中引物浓度的差异来形成单链DNA，通常侧引物的浓度为100∶1.当某一引物被耗尽后，另一引物扩增的片段即为单链然后即可用于测序，此外，获得单链DNA还有磁珠俘获法，外切酶消化法及Genomic amplification with transcript sequeucing法(简称GAWTS法).PCR直接测序的最新发展是将双脱氧络子技术与PCR技术相结合进行循环测序，在PCR反应体系中同时将ddNTP加入，并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增后，得模板的扩增与测序同时进行，其特异在于使用的模板量小且不需分离单链.

　　应用PCR测序有以下优点:

　　(1)附模板的要求，模板需要量小.

　　(2)方法简便，操作易于标准化，自动化.

　　(3)测序效率高，准确，在短时间即可完成.

　　4.PCR-寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASb)

　　如果一个基因的突变部位，性质经测序分析已经阐明，即可用该方法直接检测突变.该方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段(一般为19n+)作为探针，与经PCR扩增获得的靶DNA进行杂交，在严格控制杂交条件的前提下，通过斑点杂交式其它类型的杂交来检测PCR产物中有无丰应突变，即探针与靶DNA片段之间只要有一个碱基不相互配对或错记，就能检出.

　　(1)探针，探针一般合成两个，一个为正常序列，另一含有突变位点，前者与正常靶DNA完全互解，后地只与突变DNA互补，一般长充为19bt.该探针称之为等位特异寡核苷酸探针(allele specific oligo nucleotide probe，ASO探针).

　　(2)杂交类型，PCR技术的出现，从根本上解决了靶DNA的来源问题，使人们能在很短的时间内获足够量的靶DNA，传统的PCR-ASO技术主要是将PCR，占物固定于杂交膜上，然用不同的标记探针检测，亦有将已标记好的探针预先固定于杂交膜上，再使之与PCR产物结合，检测有无完全互补的DNA产物.

　　(3)探针的标记，最先应用的标记物为放射性物质有32P，34S，但由于其来源，半衰期及放射性危害不能普遍应用.PCR技术的引进使可在短时间内获得足够量的靶 DNA片段，因而对探针的要求亦有的降低，因非同位素标记的探针亦可获非常满意的结果，它不仅使ASO探针使用起来受加快是简便，而且无同位素半衰期的限制，操作亦受安全，适合于临床应用.目前已用PKU，β地贫杂的基因突变检测.

二、用PCR技术快速筛查突变基因

　　前边所述及的方法均可直接检出突变部位，而其前提则是突变的性质和部位必须清楚，但在许多情况下，基因突变的位点不固定，而且性质亦不是非常清楚，因此就需要用一些快速简便的筛查方法以确定检材中有无基因突变，近年来，以PCR技术为基础建立起来的突变快速筛查技术已普遍应用于肿癌及遗传病基因突变的检测.

(一)PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP)

　　PCR-SSCP是近年来发展起来的一种分析突变基因的方法，由于该方法对检测基因的单个碱量置换和某一片段DNA突变位点的筛查提供了有效而快速的手段，现已广泛应用于遗传及恶性肿癌基因突变的分析.

　　1.PCR-SSCP的原理

　　PCR-SSCP于1989年首先报道，该方法的原理是基于序列不同的DNA单链片段，其空间构象亦有所不同，当其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其泳的位置亦发生变化而表现出不同序列单链其电泳迁频率的差异，从而据引判断有无突变存在.对于一段DNA来说，其单链具有特定的空间构象，这种空间构象的形成与该段DNA的碱基序列有关，当这段DNA发生突变，基碱基序列亦发生相应的变化，空间相象亦随之改变，研究发现，不同空间构象的DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时的迁效率有所不同，这样对于同一段单链DNA来说，这种空间构象的变化及电泳迁移的改变即能说明其有突变的发生因此，可用经PCR扩增的DNA片段经变性成单链然后在中性胶中电泳，即可检出有无突变.

　　2.PCR-SSCP是检测基因中点突变的一种快速而简便的方法，可用于多个标本的筛查，应用时应注意以下问题.

　　(1)敏感性:PCR-SSCP对小于300bp的DNA片段敏感性达90-99%，一般认为随着DNA 片段的增大，其敏感性亦相应的降低，多数报道认为的检测的扩增片段以100-200nt 最为敏感，但近来的报道发现，175-345nt范围内进行PCR-SSCP灵敏度无明显变化，亦有人用多重SSCP(multiple SSCP)500nt的单链DNA点突变亦可检出.

　　(2)胶的浓度与厚度，一般浓度为5-6%，需要强调的是丙烯酰胺与双酰酰胺间的比例一般为40∶1或70∶1.胶的厚度应小于1mm.

　　(3)甘油浓度:在室温条件下，在凝胶中加入少量甘油(5%-10%)可获满意效果，在突变应用时应根据实验来确定，在其它条件都固定时，对比1%、5%、10%的甘油浓度时的检测效果，以找出最适应甘油浓度.

　　(4)电泳的浓度一般通过实验来模索最佳温度，一般以10-15℃效果较好.

　　3.PCR-SSCP结果的显示:传统的PCR-SSCP电泳结果的显示需要借助同位素标记，方法复杂，限帽了其推广.近年来非同位素方法的发展得SSCP技术得以广泛应用，避免了同痊素法清多不便，适合于临床检测的要求，非同位法有以下几种:

　　(1)非同位素标记物掺入法:可同生物素或地高亲标记的三磷酸化脱氦核苷酸掺入，然后因相应的方法显色，但该方法操作复杂，所需试剂故为昂贵是其缺点.

　　(2)SSCP银染法，是一种简便实用的方法经济，快速，可在1-2小时完成，尽管其灵敏度故同位素方法低，但可完全满足检测要求，该卫开始逐渐取代同位素显方法.

　　(3)EB染色法，方法，但安全性差(EB为致癌剂)，灵敏度低是其缺点.

　　(4)其它，尚有荧光法标记SSCP高，虽然其高效，灵敏，自动化高，但因期需要特殊设备，环以推广.PCR-SSCP的出现及应用，使人们对突变基因的检测和筛查途径大为改观，该方法胶的检测出率碱置换点突变，而且标本适用范围广，多种类型的突变(如短核苷酸片段的括小与缺失，等均可检出，而且还能应RT-PCR-SSCP及mRNA-SS CP进行分析，加上操作及技术条件易于掌握，还可适用大量标本的筛查，因而有广阔的应用前景，其缺点在于不能确定突变的部位和性质.

(二)，变性梯度胶(DGGE)，恒定变性胶(CGGE)及温度(TGGE)检测基因突变.

　　DGGE，CGGE及TGGE三种方法是基于相同的原理而设计的突变检测方法，它仍均是根据DNA的解链特性而设计.对于同一定序列组成或的DNA片段来说，它具有恒定的解链温度(Tm)，但若其序列发生改变时，Tm值亦发生改变，在含有变性因素(变性剂，高温)的凝胶半进行电泳，当其比链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会改变.Tm值全要取决于DNA的碱基组成，序列中出现单碱基替换时，Tm亦发生改变，电泳迁移率亦改变，此即DGGE，CDGE及TGGE鉴定突变的技术基础.

　　1.变性梯度凝胶电泳(denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE)

　　DGGE是检测基因突变故为精确的方法，它不仅可检测单一片段的单点突变，对多点突变的检测亦较容易，该方法与PCR技术相结合，使其能非常快速的对大量标本进行分析.

　　对于一DNA片段来说，其Tam值与基碱基组或有关，当其碱基组成发生变化时，Tm 值亦改变，因此，对于突变的片段来说，若其在一变性物质线性梯度增加的凝胶上进行电泳时，随着变性剂浓度的增加，当这种浓度达一定值时突变的DNA片段发生解链而形成分叉，其电泳迁移速度变慢.因此突变的DNA片段与正常的DNA片段电泳的迁移位置有差别，研究证明DGGE可检出任何粪型的单碱基取代，如果将突变型与正常的 DNA片段形成异源双链时，其敏感性大大提高.

　　2.恒定变性胶电泳(Constant deratarared gel electrophoresis CDGE)

　　CDGE是DGGE基础上发展起来的基因突变检测技术，亦是利用突变基因与正常基因片段间Tm值的差异来检测突变的方法，该方法与DGGE的区别在于聚丙烯酰胺中的含的变性剂浓度相当于含突变基因片段的Tm值，而且浓度恒定，而不是线性递增.为了提高DGGE和CDGE的检测敏感性，通常在一侧引物的5'端设计一含GC的区域(GC-ClampGC 钳)，避免了DNA的完全解链，从而提高了突变的检出率，可达100%.

　　3.温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis TGGE)

　　该方法是将PCR扩增的产物量一中性聚丙烯酰胺凝胶上，在一温度线性梯度上升的电场中进行电泳，当DNA双链到达其Tm时，双链解开，形成分叉，而影响电泳迁移率，突变的扩增产物其Tm值与野先型有明显不同，因而有不同的解链区，从而造成电泳迁移效率的差别，据此可判断检材中DNA有无突变.

(六)异源双链

　　在同一扩增体系中，若同时含有正常模板和突变型模板时，随着PCR的循环进行，野生型基因片段和突变型片段均可扩增，并形成了异循双链，由于异源双链中配区的出现，因而其它间构型亦发生改变，这机型上的差别即形成电泳图谱上的差异，这种方法适合于较小DNA片段的分析，一般在300bp以下，其敏感性与SSCP相似，该技术简便，适用于快速的突变检出，已用于多种遗传病基因突变的研究.

　　除上述的几种以PCR为基础的突变检出技术外，还有错配碱基化学裂解法，PCR- 产物的RNA酶检出法及引物竞争法用于基因突变的检出，尤其是错配碱基化学裂解和 PCR-RNore裂解对突变的检测仍是10前广泛应用的突变检出技术，化学裂解法以期敏感性高，检测片段长而应用更为广泛.

　　总之，以PCR技术为基础建立的基因突变检测技术有多种，而且各有其优缺点，但目前较为广泛应用的为PCR-SSCP，PCR-ASO及PCR循环直接测序，随着新方法的不断出现，将会大大的促进基因突变的研究.