PCR技术应用六：血友病A基因诊断

作者：admin 来源：本站发布时间： 2011-01-05 11:06　浏览次数：

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血友病A是常见的遗传性凝血障碍，它是由凝血因子Ⅷ的基因缺陷而致其功能异常的致其发病率改为1/1000男性，女性患者极为少见.在临床上，血友病大都有家族史，亦有约20～30%的患者为散发病例，为新生基因突变所致.

一、血友病的遗传学

　　本病为X连锁隐性遗传病，其基因定痊于Xq28.因子Ⅷ(FVⅢ)基因全长约为186Kb，包括26个外显子和25个内含子，其mRNA全长约为9Kb，CDNA占为9009bp.其翻译产物为 2351个aa残基的多肽链.在FVⅢ基因内含有多个酶切位点，在其翻译区尚有VNTR序列及(CA/n重复序列.

二、FVⅢ基因突变的特点

　　(一)大范围的缺失，重排，重复及括入仅点血友病A的5%

　　(二)FVⅢ基因突变的主要类型为单碱置换所引起的点突变，目前还发现的单碱是置及在八十种以上，几乎涉及FVⅢ的所有外显子和部分内含子.

三、PCR技术在血友病A基因产前诊断中的应用

　　FVⅢ基因突变以点突变为主，而且有高度异质性，因此对患者的诊断10前还是主要依据临床表现进行，在一个家系内若要进行血友病A的产前诊断，则必须用连锁分析的方法，该方法的应用则必须满折方法有以下两种:

(一).PCR-RFLP

　　在因子组基因内及其复侧有多组RFLP位点可用为标记进行连锁分析进行产前诊断，常用的PCR-RFLP位点有两种，其引物序列，酶切片段多者情况见下表.

位点	引物序列	内切酶	长度	酶解片段
Ext18	5'-TAAAAGCTTAAATGG TCTAGGC-3'	BclⅠ	142	99＋43
	5'-TTCGAATTCTGAAATT ATCTTGTTC-3'
Int22	5'-CACGAGCTCTCCATCT GAACATG-3'	XbaⅠ	96.0	68＋28
	5'-GGGCTGCAGGGGGGG GGGACAACAG-3'
Int19	5'-GGCGAGCATCTACAT GCTGGGATGAGC-3'	HindⅢ	717	469＋167＋81
	5'-GTCCAGAAGCCATTC CCAGGGGAGTCT-3'

(二)，Amp-FLP

　　在FVⅢ区内尚有两个VNTP区，一个位于DXS52，另一个为(CA)n位于DX102内，它仍均具有复杂的多者性，亦可用于连锁分析，是引物及扩增产物的多者性见下表

位置	引物	片段	范围
DXS52	5'GGCATGTCATCACTTCT CTCATGTT-3'	14	0.7-3.0
	5'CACCACTGCCCTCACG TCACTT-3'
DX102	5'GTAGTCTCAGTCGACA TGCTTTGAC3'	8	152±
	5'GCTGAGAAAGTAGATC CTAAGTGTTC3'

(三)血友病APCR基因诊断程序

　　1.母亲、先证者的RFLP及Amp-FLP，确定风险染色体

　　2.检测胎儿性别(SRT)

　　3.检测胎儿的RFLP及AmP-FLP

四、散发病例FVⅢ基因突变的PCR检测

　　由于因子FVⅢ的基因突变以点突变为主，而且具有高度特异性，因此，单独网点突变的检测方法仍以诊断，对于形发病例来说，可用PCR-SSCP，PCR-DGGE及其它的点突变是筛查方法确定点突变血友病A之间的关系具有重要意义，尤其是PCR-DGGE已用于血友病A基因点突变的筛查.

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