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ELISA是酶联免疫吸附测定的简称，是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。它以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合，由于抗原、抗体反应在一种固相载体— 一、试剂的选择 优良的检测试剂对于结果准确的必要性不容置疑。注意操作严格按照试剂说明书进行，试验前将试剂在室温下平衡30-60分钟。 二、加样 (一)可能出现的问题 1．血清或血浆标本分离不好即进行加样或者待检标本污染或溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。 2．手工操作中，加样板过多造成加样后放人孵箱前等待时间长(特别是室内温度较高时)，或者加样不准确，各孔标本或试剂含量有差别。 3．加完标本再加酶试剂时酶溅出。 (二)解决方法 1．可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌物(如唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA检测均以血清为标本。标本为血清：最好将血液先于室温放置1-2小时后，再用3000r／min离心lO分钟；标本若为血浆，必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000r／min离心15分钟。血清标本宜在新鲜时检测，如在冰箱中保存过久，其中的蛋白质可发生聚合，在间接ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4~C，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀，宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和。 2．在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样后及时放入孵箱温育。 3．从冰箱中取出的试剂应待温度与室温平衡后使用。加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 4．标本较多时，请分批操作。 三、孵育 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育。此过程中可能出现的问题有：孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发．吸附于孔壁，难于清洗彻底。故应注意温育的温度和时间，应按规定力求准确，如果孵育时间人为延长，将导致非特异性结合紧附于反应孔周围难以彻底清洗。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板。 四、洗板 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELISA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。采用手工洗板时，孔与孔之间液体交叉。采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足可能导致洗板不彻底；洗板针堵塞，可能导致抽吸不完全；洗板不畅可能导致洗板效果差；反应板过多可能导致洗板等待时间长。以上情况均可造成结果误差，解决的方法是保证洗液注满各孔，洗板钉畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无尘的吸水材料)上轻轻拍干；合理安排洗板时间，交替操作。 五、显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。显色剂尽量在临用前配制，不用过期显色剂肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂坚决不用；当室温较低时应适当延长显色时间；加样时保持显色剂不外流以免造成液体回流；A、B液应避免接触金属器械。 六、终止 加终止液时产生较多气泡，会导致假阳性增加，在操作中加以注意就能避免。 七、读板 读板时板底如不清洁也可能造成读数不准。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器l5～3O分钟，测读结果更稳定。
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