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小鼠内毒素中毒性休克模型及其救治药物 的药效比较
近几十年来，对内毒素休克的研究很多，但一直没有满意的治疗方法，死亡率仍高达65～80%。本实验以探讨内毒素休克的发生机制及比较一些药物治疗为目的。 一 实验方法 １．粗制内毒素；复制小鼠内毒素中毒性休克模型；测定小鼠内毒素中毒的LD50和LD99。 ２．比较一些抗内毒素中毒性休克的药物阿托品、地塞米松、复方丹参注射液、地塞米松＋复方丹参注射液合并用药的中西医结合疗法对模型小鼠休克的疗效。 二 试剂 阿托品(郑州市新郑制药厂，批号980301)，地塞米松（广州市桥制药厂，批号981209），复方丹参注射液（河南省信阳大别山制药厂，批号9810081），生理盐水，营养琼脂（上海市医学化验所试剂厂，批号970403），大肠杆菌K12W1485。 三 器械 注射器（１ml），针头（4号），小鼠罩，天平及砝码，小烧杯，滴定管，721型分光光度计（50HZ，220V，上海第三分析仪器厂制造），JY 92-2型超声波细胞粉碎机。 四 实验对象 昆明小白鼠（120只） 五 实验方法 ５．１粗制内毒素[9] 参考文献[9]的方法加以改进： ５．１．１ McFarland氏标准管的配制：1%BaCl
2 0.3ml+1%H2SO4 9.7ml制成9亿个/ml细菌的标准管。 600W），得实验用粗制的内毒素。 23克），雌雄各半，不同性别小鼠按体重随机分成6组（第六组为对照组，注射生理盐水）。每组动物称重并标记后分别按设计浓度及容积腹腔注射内毒素。记录给药时间。 25kg），雌雄各半，随机平均分为5组，各动物称重并标记。各组动物分别注射内毒素的LD99剂量。观察注射后小鼠的反应。
观察时间 死亡小鼠数目 一组 二组 三组 四组 五组 六组 1 9：15pm 1 0 0 0 0 0 2 11：52pm 0 1 1 0 0 0 3 次日1：00am 0 1 1 0 0 0 4 6：30am 0 1 2 6 5 0 5 7：30am 1 0 0 1 0 0 6 9：00am 0 0 1 0 0 0 7 9：40am 1 0 0 1 0 0 8 12：25pm 0 1 2 0 2 0 9 2：43pm 0 0 1 2 0 0 10 9：24pm 1 1 1 0 2 0 11 次日7：31am 0 2 0 0 0 0 总计 共观察48小时 4 7 9 10 10 0 药物 24小时后剩余数目（只） 72小时后剩余数目（只） 1 阿托品 3 2 2 地塞米松 6 2 3 复方丹参注射液 1 1 4 地塞米松+复方丹参注射液 3 0 5 生理盐水 0 0 内毒素是革兰阴性菌细胞璧中的脂多糖（LPS）组分，只有当细菌死亡破裂或用人工方法裂解菌体后才释放。不同革兰阴性菌感染时，由内毒素引起的毒性作用大致相似，本实验采用大肠杆菌K12W1485制取的内毒素。当血液中细菌或病灶内细菌释放大量内毒素入血时[1]，可导致内毒素血症，严重时则形成以微循环衰竭和低血压为特征的内毒素休克，死亡率极高。其病理生理特征主要为低血压，血管收缩反应性降低，弥散性血管内凝血(DIC)和多器官功能衰竭。其作用机制为：（1）内毒素引起交感──肾上腺髓质系统兴奋，使NE、5-HT增多，致小血管收缩痉挛，微循环障碍。（2）影响线粒体代谢，使自由基产生增多，致细胞膜损伤。（3）激活巨噬细胞和中性粒细胞等活性，引起TNF、IL-1，IL-6等细胞因子的释放，IL-1和TNF协同诱导血管舒张和白细胞介导的组织坏死，造成器官衰竭和死亡。诱导诱导型NO合成酶的表达，使NO增多。NO既有促炎作用，又能抑制磷酸烯酸丙酮酸生成，尤其是NO 将小鼠注入内毒素的LD99剂量，倘若不进行抢救则小鼠会14小时内全部死亡。而本实验在注入内毒素LD99剂量后半小时内分别注入阿托品、地塞米松、复方丹参注射液、地塞米松+复方丹参注射液四种抢救药物及生理盐水。注射了抢救药的四组小鼠的存活时间及存活率均明显高于生理盐水对照组。其中，注射了阿托品和地塞米松的两组的存活率相对最高，达25%；注射了复方丹参注射液的一组的存活率为12.5%；而注射地塞米松+复方丹参注射液和生理盐水的两组小鼠全部死亡。从上述结果可以看出，在本实验中选用的几种抢救药物均能在不同程度上缓解内毒素的中毒症状和提高存活率。 阿托品组的小鼠在注射药物后中毒症状在10分钟内逐渐得到缓解且存活率相对较高，可能是由于阿托品能被机体迅速吸收，因为阿托品能直接与细胞膜上的受体作用，所以对机体的作用较快，在短时间内就能缓解中毒症状。但24小时存活率为37.5%，存活时间不及地塞米松，可见其药效不及地塞米松持久，要加强药效可能应在相隔一段时间后再注射，如此反复几次。阿托品[3][6]是乙酰胆碱等受体的阻断剂，对抗其扩血管作用，使毛细血管前括约肌收缩关闭，因此回心血量增加，血压回升。大剂量使用其治疗中毒性休克，可解除血管痉挛，改善微循环。 地塞米松组的小鼠在注射药物后中毒症状的缓解不如阿托品组的明显，存活率与阿托品组相同。可能是由于地塞米松要通过细胞膜进入细胞内，与胞浆受体结合，再由胞浆转移入核内，与核受体结合形成激素 复方丹参注射液组在注射药物后的症状缓解及存活率均不如上述两组，但存活时间仍大于14小时。可能由于丹参为中药制剂，药效因而比较缓慢且较弱。丹参[2]有活血化淤、改善微循环和抗凝的作用，可明显升稳血压、减慢心率、增加尿量。其抗内毒素中毒性休克的机理可能是拮抗LPS；对抗氧自由机对细胞的损害；改善血液流变学异常，抗DIC（弥漫性血管内凝血），从而改善微循环；保护内脏细胞及亚细胞膜，从而拮抗MOF；改善肝细胞线粒体能量代谢，减轻酸中毒。 地塞米松与复方丹参注射液合用组[5]在注射药物后中毒症状有所缓解，效果与地塞米松组相当；24小时存活率为37.5%，与阿托品组相同；但48小时后全部死亡，这个结果与预期结果及参考文献所述不一致。其原因可能是药物的剂量不足，抢救不够及时，以及各种环境因素所造成，具体原因不明。此种中西医结合治疗内毒素中毒性休克的方法还有待进一步研究。 本次实验中的四组抢救组的小鼠存活率均不高，其原因可能是所注射药物剂量不足，抢救不够及时，腹腔注射的药物吸收慢且少。最主要的可能是小鼠内毒素中毒后嗜睡，厌食，不喝水，以致饥饿缺水而死。 八 结论: 小鼠注射内毒素后会出现一系列中毒症状，甚至休克、死亡。内毒素中毒性休克的抢救药物的药效强弱为阿托品>地塞米松>复方丹参注射液>地塞米松+复方丹参注射液。阿托品为药效快的短效药物，药效持续时间短；地塞米松为药效缓慢的长效药物，药效持续时间长；复方丹参注射液的药效缓慢且药效相对较弱。 1:标 题：内毒素导致休克的作用机制探讨4 著 者：段文卓; 宫海民 出 处：中国病理生理杂志 1997.04.15; 13(2): 220 2:标 题：复方丹参注射液对兔内毒素休克的防治作用 著 者：黄青青; 杨镛; 万林骏; 苏美仙; 文士铭 出 处：中国危重病急救医学 1998.04.10; 10(4): 227-230 3:标 题：阿托品解痉作用的实验和抗感染性休克作用的探讨 著 者：刘树华 出 处：论文选编·建院三十周年专辑 1981.10; : 130-134 4:标 题：肾上腺皮质激素在感染性休克治疗中的应用 著 者：汤锡龙 出 处：安庆医学 1990; (4): 21-22 5:标 题：参附柴液与地塞米松对犬感染性休克合并DIC疗效比较 著 者：刘玉英 6: 著 出 7:著 出 8:著 出 9:著 出处：中西医结合杂志 1990; (11): 675-676标 题：关于感染性休克病机理的探讨:兼述阿托品抗感染性休克的药理作用 者：黄学博 处：山东医药 1989; (11): 54标 题：消炎痛在感染性休克中的作用:动物实验和临床初步观察 者：邓杏飞 处：中华医学杂志 1988; (8): 440-443标 题：单用大剂量皮质类固醇或与其它药合用对脓毒性休克存活率的影响 者：王涛 处：战伤参考资料 1986; (2): 34-35：标 题：白藜芦醇甘对大鼠内毒素休克的影响 者：张曼 金丽娟 金春华 处：中国病理生理杂志 1997，13（3）：245
５．１．２营养琼脂按4g/100ml蒸馏水混匀，置于烧瓶中，放置20分钟，加热溶化，分装入高压容器中高压灭菌（101Kpa）15分钟，无菌状态下注入玻璃平皿中，冷却，制成平板。将斜面低温保存的K12W1485大肠杆菌接种到平皿上，划匀，于37度恒温箱中培养24小时。用生理盐水冲洗生长的细菌，制成细菌悬液。用浓度标准比浊和721型分光度计测光密度值，双重检测细菌浓度，测定结果为100亿个菌/毫升。将悬液于沸水煮沸15分钟，反复冻融3次。经初试效果稍差，进一步改用超声粉碎机粉碎细菌（500HZ，T：5min，工作时间：90s，间隙时间：5s，总定时次数：18次，W：500 ５．２测定内毒素的LD50及LD99 ５．２．１预试：取12只小鼠（14 至26克，雌雄各半），不同性别小鼠按体重随机分为三个剂量组，剂量比为1：3：9。每组分别给药3.3ml/kg,10ml/kg,30ml/kg。给药后观察小鼠出现扭体反射(与死亡正相关)的情况，观察时间为3小时。 预试结果：3.3ml/kg组4只都没出现扭体反射，10ml/kg组4只都没出现扭体反射，30ml/kg组4只都出现扭体反射，即预试的小鼠全死剂量（Dmax）为30ml/kg，全不死剂量（Dmin）为10ml/kg。
５．３正式实验：
５．３．１计算各组剂量 根据预试测出的小鼠全死剂量（Dmax）全不死剂量(Dmin)范围安排5组剂量。设n为组数，r为公比，根据r=（Dn/Dm）^（n-1）计算各组剂量。取n=5，则r=0.76，各组剂量为30ml/kg、22.8ml/kg、17.3ml/kg、13.1ml/kg、10ml/kg（每毫升细菌数：100亿个）。 ５．３．２：配制药液 ５．３．３：分组及给药 取小鼠60只（18 ５．３．４：观察与记录 记录观察时间内动物症状，中毒症状，及出现时间，死亡表现及死亡时间，计算各组死亡率。 ５．４参数的计算 用Bliss法电子计算机运算小鼠内毒素的LD50、LD99。 ５．５复制小鼠内毒素中毒性休克模型 取小鼠40只（体重15 ５．６救治内毒素中毒性休克药物的药效比较。 待上述六组小鼠出现中毒症状后，马上分别注射药物（腹腔注射）。每组注射药物如下： 第一组：阿托品（浓度0.5mg/ml，注入0.08 ml/g，分三次完成，每次间隔一小时）；第二组：地塞米松（浓度0.35 mg/ml，注入0.02ml/g）；第三组：复方丹参注射液（浓度1.5 mg/ml，注入0.6ml/只）；第四组：地塞米松+丹参注射液（浓度同上,注入0.2ml+0.4ml,一小时后再注入地塞米松0.2ml）；第五组：（对照组）生理盐水（0.6ml/只）。 观察记录注射药物后动物的存活数，计算存活率，比较各种药物的药效。
六 结果:
作者: 黄慧梅 苏洁明 赵娅敏 马滚韶 指导老师:林老师(实验生理科学) 吴志均(微生物) 诸辉(分子医学中心) 摘要 关键词 ６．１:内毒素(LPS)的LD50及LD99 小鼠打入内毒素半小时后出现明显的扭体反射及收腹效应，一至五组出现的数目分别为2、5、6、8、9只。小鼠烦躁不安，气喘，呼吸困难，呼吸加快，排便增多，继之出现活动明显减少，嗜睡，挤成一团。口唇无明显紫绀。 观察两天，小鼠死亡时间及数目见表一。小鼠死亡前翻正反射消失，口唇明显紫绀，呼吸26次/min──34次/min且逐渐减少，腹泻，肌张力明显降低，角膜反射（+），痛觉反射（+）。死亡症状为先肌张力降低，抽搐，打颤，然后死亡。 表一：小鼠死亡时间及死亡数目（每组原有小鼠10只）
各组剂量分别为：10ml/kg, 13.1ml/kg, 17.3ml/kg, 22.8ml/kg, 30ml/kg 第四、五组的高浓度组小鼠死亡集中在注射内毒素后8至14小时,低浓度组死亡的时间分散在不同时间段。死亡数按给药浓度从高到低为10、10、9、7、4，基本符合预期结果。自然死亡率为0。内毒素LD50的具体计算见表二。 LD50= 9.9ml/kg LD95= 23.9ml/kg LD99= 34.4ml/kg ６．２:药效比较 小鼠注射内毒素后的症状与测定LD50时的症状相同。注射抢救药物后，与生理盐水对照组比，中毒症状有明显缓解，活动能力稍强，且比没抢救前强，呼吸稍平稳，扭体反射及收腹效应消失。但与中毒前相比，不如中毒前活泼，缩成一团，嗜睡。注射了抢救药物的小鼠的存活时间明显长于注射生理盐水的对照组。生理盐水对照组小鼠的存活时间为8至14小时，无中毒减轻；抢救组的存活时间为24至72小时及72小时以上。死亡小鼠的症状与测定LD50时的相同。具体注射抢救药物后的小鼠存活时间及存活数目见表三。 表三：注射抢救药物后小鼠的存活时间及存活数目 实验动物:小白鼠 给药方式:腹腔注射 剂量组数:5 每组原有小鼠8只
七 讨论: 前 言 |
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