器材与试剂：
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。
具体步骤：
一 . 水的制备：
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。
二 .PBS 的制备与消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：
1. 溶解定容：将药品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。
2. 移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三 . 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1. 称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4℃ 内过夜。
2. 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（ 0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20℃ 保存以备使用。
四 . 抗生素溶液的配制
1. 所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅 高压 20 分钟灭菌。
2. 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。
3. 使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 1 单位＝ 1 微克？
4. 细胞库之细胞培养基不加抗生素
5.培养自ATC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。
6. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通 过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
7. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml)
8. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。
9. 去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml
注意混合使用后药物毒性会增强。
10. 抗生素使用种类与浓度：
工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
五 .RPMI1640 的制备与消毒：
1. 溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml 。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ，摇匀。
2. 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3. 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4. 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4℃ 冰箱内待用。
5. 使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 时两周有效）。
六．血清：
１.血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56℃ 水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
1. 血清必须贮存于–20 ～ -70 ℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可
将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀
体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清 入
培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 ℃ 或–70 ℃ 至4 ℃ 冰箱溶解一天，至室 温下全
溶后再分装，一般 50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇 晃均匀(小心勿
造成气泡 ，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由－２０ ℃ 直接 至３７ ℃ 解冻，因温度
改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均 匀。此
热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般 议作此热处理，
因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应
有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and
platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell
type。
５.勿将血清置于３７ ℃太久，若在３７ ℃ 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定
之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后
血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本 身之品质。若欲减少这
些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上 清液可以加入培养基中一起过滤。
不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀
物在显微镜下观察像是 小黑点 ，常会误认为血清遭受污染，而将血清 放在３７ ℃中欲培养此 微
生物“，但在37 ℃ 环境下，又会使此沈淀物增多，更 会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之
培养基检测，又没有污染。一般而言，此黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品
应立即停用，更换另一批号的血清。
七 .HEPES 溶液：
HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（ N'-a-hydroxythylpiperazine-N'- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓 度为 10-50mmol/L ，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下：
准确称取 HEPTS 238.3g ，加入新鲜三蒸水定容至 1L 。过滤除菌，分装后 4℃ 保存。
注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。
八 . 谷氨酰胺：
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50 ％，故应单独配制，置于 -20℃ 冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4℃ 冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1 ～ 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶， -20℃ 保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。
九 . 肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml 。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克 / 瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 ℃ 。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml （精确可加入 0.9ml ）即可。
十 . Ⅰ 型胶原酶：
0.1 ％ Ⅰ 型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为 Ⅰ 型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶 -20℃ 保存。
十一 . 明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制 0.1 ％明胶溶液必须用无菌的 PBS 配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1 克 （配成 100ml 溶液） — 即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是 01. 的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入 50ml 小瓶中， 4℃ 保存。
注意事项：
1. 配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2. 安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3. 配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。
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