(二)　操作步骤

　　方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。

　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：

　　　　　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，
　　　　　　每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔
　　　　　　中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，
　　　　　　37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

　　　　　　　　　　　　　　↓

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

　　(三)　试剂器材

　　1.　试剂

　　(1)　包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):

　　　　　　NaHCO３   1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸馏水至1000ml

　　(2)　洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0.15M

　　　　　　KH₂PO₄ 　　　　　0.2克

　　　　　　Na₂HPO_４·12H₂O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸馏水至1000ml

　　(3)　稀释液：

　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

　　　　　　　加洗涤缓冲液至100ml

　　　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

　　(4)　终止液(2M　H２SO４）：

　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

　　(5)　底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):

　　　　0.2MNa２HPO４(28.4克／L)25.7ml

　　　　0.1M柠檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml

　　　　加蒸馏水50ml。

　　(6)　TMB(四甲基联苯胺)使用液:

　　　　TMB(10mg／5ml无水乙醇)0.5ml

　　　　底物缓冲液(PH5.5)　　　 10ml

　　　　0.75％H２O２　　 　32μl

　　(7)　ABTS使用液:

　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg

　　　　底物缓冲液(PH5.5)　 1ml

　　　　3％H２O２　 　2μl

　　(8)　抗原、抗体和酶标记抗体。

　　(9)　正常人血清和阳性对照血清。

　　2.　器材:

　　(1)　聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

　　(2)　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　(四)　注意事项

　　1.　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

　　2.　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

　　(1)　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

　　（2） 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

　　(3)　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。