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ELISA试剂盒使用说明书-人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)
本试剂盒仅供体外研究使用!
预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中VEGF165含量。
实验原理
用纯化的VEGF165抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的VEGF165抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的VEGF165呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（ OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1、 酶标板：一块（96孔）
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖
好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为5,000 pg/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 pg/ml。如配制2,500 pg/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）5,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。
6、 检测溶液A：1×120/瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A 1:100稀释（如：10检测
溶液A / 990检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量
配制（100/孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。
7、 检测溶液B：1×120/瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检
测溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5张
12、使用说明书：1份
自备物品
1、 酶标仪（建议仪器使用前提前预热）
2、 微量加液器及吸头，EP管
3、 蒸馏水或去离子水，滤纸
标本的采集及保存
1、 血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可
检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
2、 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000g离心15分钟，
取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
3、 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37溶解）；试剂或样品配制时，
均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100，余孔分别加
标准品或待测样品100，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及
孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37温育2小时。为保证实验结果有效
性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100（临用前配制），酶标板加
上覆膜，37温育1小时。
3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400/每孔，甩干（也可轻
拍将孔内液体拍干）。
4、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制） 100，加上覆膜，37温育1小时。
5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6、 每孔加底物溶液90，酶标板加上覆膜37避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当
标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。
7、 每孔加终止溶液50，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物
液的加入顺序相同。
8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。
注：
1、 试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。
实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2、 加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不
同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准
品及所有样品）最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、 温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；
洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给
定的温育时间和温度。
4、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中
吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。
5、试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁
或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需
的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配制标准品及工作液，尽
量不要微量配制（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10），以避免由于不准确稀释
而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B
工作液。
6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如
颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
洗板方法
1、 手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去（不可
触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几
次；根据需要，重复此过程数次。
2、 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人VEGF165，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
各标准品O.D.值扣除空白孔O.D.值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标）， O.D.值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert 1.3，根据样品的O.D.值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
检测范围：78 pg/ml - 5,000 pg/ml，绘制标准曲线请取用以下浓度值：5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml。
最低检测限：20 pg/ml
说明
1、 在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和微生物的
污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2、 试剂盒保存：请收到试剂盒后尽快将标准品、检测溶液A和检测溶液B保存于-20，其余试
剂短期保存请置于4，长期保存则置于-20。开封后的酶标板要密封加干燥剂后保存于
-20，避免潮湿。
3、 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4、 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
5、 有效期：6个月。
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