|
||||||||||||
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
| 购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于2001年的毕特博生物 www.bitebo.com |
一、标本采集 2、标本确认 在采集患者标本前必须对患者进行确认。标本应该在患者在场时标记，不能事先标记也不能等患者走了之后才标记。运送到检验科的标本应该用粘贴牢固 的标签，至少包括以下信息：患者全名、唯一的编号、采集日期、采集者的姓名、标本类型和检测方法。如果使用条形码，则按条形码的规定进行标识。 3、申请单 检测申请单必须和患者标本一起送到实验室。申请单应该包括以下信息：患者全名、唯一的编号、接受编号、出生日期、标本采集时间、标本类型、检测 方法、相关临床和实验室信息、医生的姓名、标本采集部门、结算信息和其他信息。在某些情况下，还需要其他的信息。比如基因检测要写明申请检测的理由，因为 检测人员要根据患者的年龄和其他信息来判断检测项目的选择是否恰当。某些基因检测还需要患者同意。 4、标本获得方法 在采集人体组织或体液时必须戴手套。手套可以防止经血液传播的感染和操作者的脱落细胞污染标本。所有操作都应该遵循安全防范规定（详见CLSI M29关于实验室工作人员防止职业获得性感染）。 5、用血浆的凝血检测标本采集技术 （1）设备 推荐使用血液采集系统将静脉血标本直接收集到含有适当抗凝剂的玻璃或塑料容器中。用于凝血检测的标本应该收集在非活性表面的容器中。正确的静脉 穿刺技术详见CLSI H3。典型的采血装置是一根指针与容器连接。带翼的针对婴儿、儿童、静脉较小或者经常用静脉扎针者较适用。带翼的采血针的一头带有一个柔韧的塑料翼，便于 将针头插进血管。针的长度可根据需要灵活选择。无论是用于真空采血系统还是注射器，过小的针头可能会引起溶血。 用于血凝检测的标本可以收集到注射器中，注射的内表面必须是非活性的（如聚丙烯），注射器内应该加入适当的抗凝剂。抽血过程必须在1分钟内完 成，标本进入注射器后迅速混匀。使用皮下注射器和针头可能会引起溶血并且存在安全问题。推荐使用小体积注射器（不超过20ml），若使用大体积的注射器会 增加凝血的可能。血液可以通过安全转移装置从注射器转移到带橡胶活塞的真空试管中。先将试管用固定装置固定，不能手拿。然后让血液缓慢的流入试管中。太快 可能会引起溶血，影响整个测试过程。转移过程中不能用力按压注射器拉杆，这样容易使试管活塞滑落，血液喷洒。当转移完毕将针头从真空管内移出时应该注意防 止注射器中的血液继续流出（详见CLSI M29）。 在某些情况下，用于凝血检测的血液标本可能从血管辅助装置（vascular access device，VAD）中抽取，然后用血液收集系统或注射器收集。在使用血管辅助装置采集静脉血时，应该确保整个血液采集系统（VAD、注射器，采血针和 收集装置）不漏气，否则会引起溶血和样本抽取的体积不对。尽量不要提前在血液收集管道中注入肝素。如果必须要要用VAD采集标本，应该考虑到肝素可能造成 的污染和稀释。如果标本收集管道中注入了5ml盐水，那么前5ml或者VAD的6倍死腔体积的血液应该弃去。如果怀疑标本可能有肝素污染，检测前应该去掉 或中和混有的肝素。如果标本是从封闭管中抽取，要弃去2倍导管和延伸装置的死腔体积的血液。 所有含有抗凝剂的收集容器（如试管或注射器）采集完标本后都应该颠倒混匀3到6次以确保标本和抗凝剂充分混匀。不要剧烈摇动，以免造成溶血或血小板激活聚集，导致检测结果错误。 （2）废弃试管 有人提出了废弃试管的假说，即用于常规凝血检测的标本在收集前必须将前一部分血液抽到废弃试管中并遗弃以避免组织凝血活酶对结果的影响。然而， 也有研究表明没有使用废弃管对凝血酶原时间（PT）(INR)和活化部分凝血活酶时间（APTT）的结果并没有影响。也有证据表明其他的凝血检测项目最好 使用废弃试管。但是至今还没有公开发表的数据和文章明确的说明使用真空采血装置时是否有必要使用废弃管。使用带翼的血液采集装置用于静脉采血时，先用凝集 管收集血液然后将血液遗弃，目的在于将标本收集试管中的死腔填满，以保证合适的抗凝剂和血液比例。有的采血中心使用双注射器技术采集血凝检测标本。首先用 不含添加剂的试管采集标本，将针头留在血管里，小心的切换含抗凝剂的注射器以采集，第二管血用于血凝检测。 （3）标本采集容器（试管和注射器） 用于凝血检测标本收集和保存的容器必须是非活性表面。玻璃容器必须是用高质量玻璃做成并且要硅化使其表面是非活性的。塑料容器应该是由非活性材料如聚丙烯组成，不能用聚苯乙烯。 如果改变了容器的种类或者厂商，应该做一个平行试验来评估不同材质或不同厂商生产的试管对凝血检测结果是否有影响。由于不同容器造成的结果改变可能对正常参考值范围内的标本不明显，但是对超出正常范围的标本明显。 第二个试管或抽样试管也应该是由非活性材料如聚丙烯组成，不能用聚苯乙烯。试管必须有适当的标记。 （4）抗凝剂 凝血检测的抗凝剂推荐使用浓度为105~109mmol/L，3.13%~3.2%的二水合柠檬酸三钠（Na3C6H5O7?2H2O）。此 外，129mmol/L，3.8%的水合柠檬酸三钠也可用。但即使柠檬酸钠的浓度在3.2%~3.8%之间，正常范围也不同，特别是当检测值落在参考范围 外时，因此实验室应该规定柠檬酸钠的一个标准浓度。由于3.8%的柠檬酸钠结合的钙更多，因此凝血时间比使用3.2% 的柠檬酸钠更长。 109mmol/L柠檬酸盐缓冲液含有茶碱、腺苷和双吡啶（CTAD），可使血小板的活性最小，也可用于凝血检测。不能用其他抗凝剂，如草酸盐、肝素或EDTA。 最近出现了新的抗凝剂pH4.3的0.45mol/L的柠檬酸钠缓冲液，较强的酸性可稳定血浆中的纤维蛋白溶解因子和凝血系统的其他物质，如可 溶性的血栓调节蛋白和血管性血友病因子（vWF因子）。此外，柠檬酸盐与蛋白酶抑制剂如D-苯丙氨酰脯氨酰精氨酰氯甲酮（PPACK）结合可保护血浆样本 的完整性。 以前，其他用于弥散性血管内溶血（DIC）的非常规凝血检测需要非血浆样本。由于多价抗体可能与纤维蛋白原发生交叉反应，用于纤维蛋白降解产 物、纤维蛋白分解产物和纤维蛋白裂解产物检测必须使用血清样本。样本收集在含有凝血酶和胰蛋白酶抑制剂的试管中，有时使用立止血酶，因为最近由于纤维蛋白 降解产物（FDP）单可隆抗体的发展，避免了与纤维蛋白原的交叉反应，使得FDP可用血浆检测。有研究显示，用血清检测的旧方法不如用血浆检测的新方法准 确。若凝血块中结合了FDP可使FDP值偏低，若血凝块形成产生了FDP可使结果偏高。 （5）血液与抗凝剂的比例 使用血浆作为标本的血凝检测，血浆和抗凝剂的体积比试9：1。采集装置不恰当可能使这个比例降低从而影响实验结果。当血浆实际的填充体积减少 时，血浆与抗凝剂的比例小于9：1将导致凝血时间延长。这种情况下使用3.2%柠檬酸盐抗凝剂受到的影响较使用3.8%浓度的柠檬酸盐抗凝剂要小。血浆与 抗凝剂比例不当的影响还取决于APTT和PT反应试剂以及试管的体积。除非有特殊说明，一般推荐使用90%的填充体积，若小于90%填充体积INR则会延 长。儿童用真空试管（不超过2mL）比标准的5ml试管对体积的误差更为敏感。详见CLSI/NCCLS H1。 （6）柠檬酸浓度的调整 当患者的红细胞压积（HCT）大于0.55L/L（55%）时，柠檬酸的最终浓度应该根据患者的红细胞压积来调整，可以使用图1来确定标本采集 时所需的抗凝剂和血液的量。HCT增高的患者，血液与抗凝剂的比例小于9：1.试管中的柠檬酸相对增加，检测反应中结合的钙离子更多，同时由于抗凝剂的稀 释效应可能延长凝血时间。对于HCT大于0.55的患者，可用下面的公式计算所需的柠檬酸体积： C=（1.85 x 10-3）（100-HCT）V C是所需的柠檬酸体积；HCT 是指患者红细胞压积；V是采血的量 （如果是5mL的试管，则V是4.5mL）；1.85 x 10-3是常数（考虑到柠檬酸的体积，血液的体积和柠檬酸的浓度）。 由于患者HCT的高值一般在0.55（55%）-0.65（65%）之间，所以一般情况下可去掉0.1ml的柠檬酸。这样实验室可以事先准备一 些调整后的采血试管备用。血标本和其他凝血标本一样混匀处理。在实验室的记录和患者的报告中应该注明患者HCT的增高和柠檬酸经过的调整。对于HCT小于 0.20L/L（20%）的标本，现在还没有推荐的调整浓度。 （7）不合格标本 不合格标本包括：标本凝血；抗凝剂使用错误（如使用了EDTA或肝素）；血抗凝剂的比例不是9：1；使用了活性表面的容器或不适宜用于检测的容器。 一般来说标记错误或没有标记的标本都是不合格的。但是如果实验室管理者授权或者临床医师有约定，标本可以检测，但是需要遵守一定的程序。所有的非常规检测的申请都必须有记录。每项检测的标本可接受标准应该是实验室操作规程的一部分。 6、分子止血检测的标本采集技术 分子止血检测的DNA可从全血细胞标本或口腔涂片中获得。静脉血标本应该直接收集到含有适当抗凝剂的真空玻璃管或塑料试管中。正确的操作详见CLSI H3。口腔涂片必须按照实验室标准操作程序采集标本。 DNA可从多种标本中获得，包括全血、干血、口腔、唾液和血浆。DNA标本的质量和分子重量各不相同，取决于标本采集、处理、操作和保存技术。以下关于标本采集的建议只是一般的指南，实验室应该根据厂商的说明采集与试剂盒匹配的标本。 （1）抗凝剂 血标本：抗凝剂的选择应该根据核酸的来源、检测的项目以及所需的标本体积。有研究显示溶液中存在肝素和血红素或血红蛋白可能抑制PCR反应。因 此，推荐使用EDTA和酸性柠檬酸盐葡萄糖（ACD）。此外，标本还可以在柠檬酸钠、凝血或冰冻全血采集。高质量的DNA可以从冰冻的全血标本中提取，但 需要修饰DNA的提取技术。有研究报道可用肝素酶去除标本中的肝素。若使用EDTA，核酸在细胞中的标本收集不能使用带分离胶的试管，否则血细胞或血小板 会在分离胶的下层，细胞中的核酸不能提取出来。带分离胶的试管只能用于被测的核酸在血浆中的样本。 其他标本：DNA也可在口腔、唾液、干血中提取。所使用的拭子或滤纸应该经过处理，以防细菌生长抑制核酸酶的活性。 （2）不合格的血标本： 不合格的血标本包括：标记不恰当；抗凝剂使用不恰当；疑混有其他标本。 一般来说标记错误或没有标记的标本都是不合格的。但是如果实验室管理者授权或者临床医师有约定，标本可以检测，但是需要遵守一定的程序。所有的非常规检测的申请都必须有记录。每项检测的标本可接受标准应该是实验室操作规程的一部分。其他信息详见CLSI MM13。
二、标本运送 按照美国疾病预防和控制中心（CDC）、美国运输部（DOT）、以及国际航空运输协会（IATA）的有关规定包装和运输的有害材料被列为“危险品”，危险物品可能会危害健康、安全、财产或环境。临床/诊断标本被列为危险品，必须按照IATA的要求进行包装和运输。 1、用血浆的凝血检测 用于凝血检测的标本应保持室温，按照相关规定运送，避免造成感染。对于多数用血浆的血凝检测不推荐使用冰块，因为低温可活化VII因子，损失 vWF因子和破坏血小板。应避免高温或低温运输。理想情况下，从标本采集到运送至标本处理处应该在1小时内。标本运送可接受的时间根据检项目而定。如对于 PT检测，延误时间在24小时内可接受；对于普通肝素治疗监测，由于肝素可以被血小板因子4中和，因此用柠檬酸盐做抗凝剂时从标本采集到离心的时间间隔不 能超过1小时，用CTAD作抗凝剂不能超过4小时。使用气动导管运送标本时应注意防止震摇，避免蛋白失活或由于标本中的泡沫使血小板活化。 若对标本处理有特殊要求应告知负责的运送员。每个标本都应有以下信息：运送员接收标本的时间、实验室接收标本的时间和接收时标本大概的温度。实验室工作人员应该根据他们的工作经验对不同标本进行处理。 2、分子止血检测 实验室应该根据厂商提供的试剂盒说明和地方、国家对标本运送的规定进行标本的收集和运送，并且为标本运送人员提供运送说明。 标本运送时应注意以下几点：运送人员收到标本的时间、实验室接收标本的时间及实验室收到时标本的大概温度。此外，实验室应根据自己的经验处理不同类型的标 本。详见CLSI MM13。 （1）全血 理想情况下，DNA从新鲜的抗凝（EDTA或柠檬酸）全血标本中提取，室温保存用于检测。提取前2-8℃也可保存3天。没有研究证据表明DNA 提取前标本最长能保持多少天，有人报道可保存长达922天。由于自动除冰冰箱的温度在一天内循环改变，可使核酸降解，因此如果血标本要冰冻保存不应使用自 动除冰冰箱。如果DNA不能在数天内提取，血沉棕黄层细胞（或压缩细胞）可于-80°C保存。 （2）其他标本 用于DNA提取的唾液、口腔涂片、口腔冲洗液可保存2年。有研究报道用于DNA提取和基因分型的干血滤纸片标本可保存11天。而保存超过7天的口腔标本不适宜用于基因分型。 三、标本处理 1、用血浆的凝血检测标本处理 离心前，将标本轻轻倒置观察，从整体上检查标本有无血凝块。去盖后插入两根小木棒看是否能挑出小凝块。但微小的血凝块用这些方法都无法检查出 来，如存在则可能对结果会产生影响。为获得血浆标本，以产生低血小板（PLT<10 000/μL）的血浆所需的离心速度和时间进行离心。离心时应采用水平转子以免血浆污染血小板或其他血细胞，特别是血浆移去后标本还要用于其它检测或者冰 冻保存。实验室应根据各自的条件做一定的试验来确定最佳的离心时间和速度，通常来说在室温下1500g不小于15分钟。也可用被称作“statfuge” 的高速短时间离心。为了保证离心后的血小板计数在可接受范围内，每6个月或离心设定改变应该对离心程序的可靠性进行确认。两次离心可确保血小板减少到规定 数量，在初次离心后用塑料吸头将血浆转移到另一个非活性表明的塑料离心试管中进行第二次离心。在吸取第一次离心后的血浆时应注意避免将管底的血小板吸入第 二次离心的试管。 血浆样本可通过0.2-μm过滤器过滤以达到减少血小板的目的。但是这种方法并不适用于所有的血凝检测。由于过滤选择性的去除了V、VIII、 IX、XII和vWF从而使APTT结果延长。考虑到这一点，不推荐使用过滤器的方法。少血小板的血浆对于冰冻后进行的检测十分关键，但是若用新鲜血浆作 为检测APTT、PT/INR和TT时，血小板含量达200 000/μL也不影响检测结果。 不管是用光学的还是机械的终点检测体系，不能使用肉眼可见溶血的标本，溶血标本的凝血因子可能被激活，从而影响检测结果。由于溶血标本对透光率有干扰，所以使用光学检测系统的影响更大。对疑似有血红蛋白存在的标本，又不是拒收标本，最好使用机械终点检测系统。 光学终点检测的仪器容易受到黄疸、血脂或者其他干扰透光率物质的影响。有人建议使用超离心来解这个问题，但是还没有公开发表的文献。有些未发表 的研究显示对于脂质样本，PT和APTT值会减少，纤维蛋白原水平增加10-15%。在有研究公开发表或实验室在对这一程序确认之前，尽量使用机械或电学 方法检测黄疸、脂质或含其他干扰透光率物质的标本。 2 分子止血检测标本处理 DNA检测的核酸标本准备有很多方法，这一步对最终的检测结果十分关键。不管检测方法是自己制定，还是参考文献从厂商购买都应该确保有一个可接 受的协议可遵循。在整个性能核查过程中都应该使用已确认的方法并遵循相应的协议。然而很多方法在协议和使用的材料方面不相同。不管是用什么程序，保持临床 标本中核酸的整体性很重要。同样也应该在最后的标本准备过程中充分稀释不纯的物质以消除检测的干扰。 要记录所用方法的程序，包括用于DNA纯化的物质的来源。若有变动应经实验室负责人同意并记录下来。关于检测设计、准备和操作程序的维护详见CLSI/NCCLS GP2。更多关于标本处理的信息见CLSI/NCCLS MM1。 （1）DNA分离 传统的DNA分离需要溶解细胞和蛋白溶解酶，如蛋白激酶K，消化结合在DNA上的蛋白质。然后用RNA酶破坏RNA，有机溶剂出去残留的蛋白和 细胞的其他成分，最后用乙醇沉淀DNA。纯化的DNA可用离心或玻璃棒搅拌收集，然后Tris缓冲液中悬浮。应避免过分的干燥，否则影响DNA结构完整 性。商业的试剂可简化核酸分离步骤，减少所需时间。各方法所使用的试剂程序都不同。很多试剂盒使用其他物质替代有机溶剂和乙醇可以减少危害。实验室在将 DNA纯化体系用于常规工作时应对其效率、兼容性和DNA纯化进行评估。 （2）用于扩增的DNA分离 Southern印记比PCR或其他扩增方法对DNA制备要求高。这些检测都需要高纯度的DNA，参考文献中的方法或使用快速试剂盒很方便且经 济。一般简短的方法可用小体积的血液或其他来源的细胞。在大多数情况下用蛋白酶K、碱、Tris缓冲液裂解细胞。然后中和裂解产物，离心去除细胞碎片。裂 解液可直接用于扩增。关于DNA分离详见CLSI/NCCLS MM5。 四、标本保存 1、用血浆的凝血检测标本保存 （1）短期保存 标本从采集到检测的可允许时间间隔取决于检测项目以及运送和保存的温度。血凝检测的标本应该戴帽保存，尽快检测。保存可参照以下指南。 PT：PT检测的标本可以不离心保存，也可以离心后将血浆置于细胞成分上面封闭保存，室温条件下可保存24小时。标本的稳定性取决于检测系统 （凝血活酶试剂、仪器和收集容器）。每个实验室都应该确认其检测系统的稳定性。全血标本应该室温保存，避免机械搅拌，否则会使PT/INR值偏高，其机制 不明。采集标本后迅速离心可保持室温下标本的完整性。不推荐将标本保存在2-4℃，以免激活VII因子使PT检测结果改变。此外，除非反应试剂中含有肝素 中和剂，否则保存时间可改变用肝素或茴香豆素治疗的患者标本PT值。 APTT：不含肝素的APTT常规检测标本可以不离心保存，也可以离心后将血浆置于细胞成分上面封闭保存，室温条件下可保存4小时。若实验室需要将标本保存4小时以上，则应该进行室内评估。评估应包括正常和异常的APTT标本凝血因子的活性（V和VIII）检测。 APTT- vWF：若要检测凝血因子VIII和vWF因子活性的标本在室温下保存更好，不应保存在2-4°C，因为低温可使凝血因子VIII和vWF因子的活性逐渐丧失，导致误诊为凝血因子VIII缺乏或vWF因子相关疾病。 APTT-UFH：可能含有普通肝素（unfractionated heparin，UFH）的标本应该在室温保存，采集标本后1小时内离心，在4小时内进行检测。若不能在1小时内离心，用CTAD可以提高其稳定性。但是需测定基质的治疗性APTT肝素范围。 APTT-其他：T用于其它检测的标本（如抗Xa因子、TT、蛋白C和V因子）应该室温保存，在标本采集后4小时内离心检测。尽管现在支持将血浆与细胞成分分离的数据很有限，但仍然推荐使用这种做法。若实验室需要将标本保存4小时以上，则应该进行室内评估。 如果PT检测的标本不能在24小时内完成，APTT检测不能在4小时内完成，则避免摇起底层的细胞，应该将少血小板的血浆转移在-20℃以下短 期保存，在-70℃以下长期保存。保存时应该使用手动除冰的冰箱，不适宜用周期性自动除冰冰箱，否则会激活VII因子。冰冻标本应在37℃下迅速解冻，温 和混匀后马上检测。混匀是关键，某些蛋白质沉淀可能出现冻结。
（2）长期保存 与标本的短期保存相比较，关于血凝标本的长期保存的文献较少。长期保存的数据也是根据经验来定的，缺乏科学的研究。已发表的文献数据大部分来源 于血库和输血科。这些机构做的血凝检测较少，标本通常保存在CPDA或CPD抗凝剂中而不是柠檬酸盐。Woodhams等报告了24个月保存的冰冻血浆的 稳定性。在这篇研究中，血标本从6个正常捐献者通过血浆去除术采得，然后将标本保存在0.129M的柠檬酸缓冲液中。将每个捐献者的血浆分装到1 mL和3mL保存试管中（使死腔最小）。然后评估5种冰冻条件和两种长期保存温度（-24℃和-74℃）下的18项血凝检测，包括4项筛查检测、8个凝血 因子、4项功能检测和2项免疫检测。 这项研究的数据为我们提供了长期保存标本的指南，见表2。从表中可看出，若将血浆标本初次检测与低温下保存后检测的变异控制在±5%，标本可在 0.129 M的柠檬酸盐在-24℃保存3个月，超过3个月则需在-74℃以下保存。在-74℃下所有的检测项目的变异都在±10%内，至少可以保持18个月的稳定 性。
以上数据为我们提供了长期保存标本的指南，但是必须考虑以下因素对血浆长期稳定性的影响因素。首先，研究中使用的是体积较大的血浆去除器采集标 本，而常规使用的是较小的静脉采血。其次，研究使用的是正常捐献者的标本，没有评估患者标本。最后，研究不是使用CLSI推荐的0.105-0.109M 的柠檬酸钠作抗凝剂。 （3）不合格标本 以下标本不适合用于检测：凝血；抗凝剂使用不当；血液抗凝比例不当；没有标记或标记错误；使用的容器不当；严重溶血；全血标本在处理前冰冻；用于PT检测的全血样本在检测前放入冰箱；用于vWF或VIII因子检测的全血样本在处理前放入冰箱。 2 用于分子止血检测的标本保存 DNA是相对稳定的大分子物质。一旦分离成功，可在2-8℃下保存至少1年，在-80℃以下可保存更久。DNA一般保存在溶液中，用于PCR或 限制性内切酶消化的DNA可保存在双蒸水中。Tris/EDTA （pH7.2）被认为是最佳的DNA保存溶液，因为缓冲液可限制PH的变异，在水中可导致DNA的自发降解。核酸在溶液中长期冰冻保存不会影响其特性。若 要保存的DNA经常要用来检测，可分装保存。分装保存既可以避免重复冻溶对DNA的影响，也可以避免污染。 （1）长期保存纯化DNA的建议 0℃以下可抑制DNase的活性，DNA可长期保存（至少1年）。纯化的DNA应保存在戴帽的、不透水的塑料试管中，放置一个橡胶垫可防止蒸 发。聚丙烯试管可能吸附DNA，特别是在高离子强度下。聚乙烯试管吸附DNA的能力比聚丙烯更强。经过特殊设计的聚丙烯试管或异质同晶聚材料试管特别适合 DNA的保存。 纯化的DNA保存在Tris-EDTA (TE )中，若不存在Dnases污染，室温下可保存26周；2-8℃至少可保存1年；-20℃下可保存7年；-70℃下至少可保存7年。不是很纯的DNA最好 保存在-20℃以确保DNA的完整性。用于DNA保存的冰箱不能使用自动除冰冰箱，因为循环的温度变化可能导致核酸的降解。 （2）不合格标本 以下标本不适合用于检测：没有标记或标记错误；怀疑有其他标本污染；溶血或使用抗凝剂不当；口腔涂片拭子有水分迹象或有细菌或真菌生长的迹象。 |
购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于2001年的毕特博生物
www.bitebo.com |
|
