【实验目的】
了解脉冲凝胶电泳的工作原理，并学习和掌握有关的操作技术。
【实验原理】
大分子 DNA( 一般长度超过 20kb ，在某些情况下，超过 40kb) 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别 ( 也称 “ 极限迁移率 ”) ，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在 10 ～ 2000kb 之间的 DNA 片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的， DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小， DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的 DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的 PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法 (FIGE) 。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳 (FIGE) 设备能把大小范围在 10 ～ 2000kb 的 DNA 片段分开。 FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到 10Mb 。
【仪器、材料与试剂】
1、制备 DNA 样品所需材料：
1)TEN 缓冲液 (0.1mol/LTris ， pH7.5 ； 0.15mol/LNaCl ； 0.1mol/LEDTA) 。
2)Seaplaque 琼脂糖 (EC 缓冲液中浓度为 2%) 。
3)EC 缓冲液 (6mol/LTris ， pH7.5 ； lmol/L NaCl ； 0.5% Brij58 ； 0.2% 脱氧胆酸盐 (Deoxycholate) ； 0.5% 十二烷基肌氨酸钠 (Sarcosyl) 。
4)ESP 缓冲液 (0.5mol/L EDTA ， 1% 十二烷基肌氨酸钠， lmg/mL 蛋白酶 K) 。
5) 溶葡萄球菌素 (5mg/mL) 。
6)RNase(10mg/mL) 。
7) 胶模 ( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品 ) 。
8) 苯甲基横酰氟 (PMSF)(17.4mg/mL 于乙醇中 ) 。
9)0.5μg/mL 溴化乙锭
2、分离、纯化大的 DNA 片段所需材料：
1) 紫外递质。
2)10mg/mL tRNA 。
3)5mol/L NaCl 。
4) 苯酚 / 氯仿。
5)3mol/L NaAc ， pH5.2 。
6)95% 乙醇。
3、设备：
1)TBE 缓冲液。
2)Seakem HGT 琼脂糖。
3)Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。
4) 变速泵或蠕动泵 (Bio-Red Laboratory) 。
5)IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。
6) 缓冲液冷却循环器 (Fotodyne ， New Britain ， WI) 或 Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory) 。
【实验步骤】
1、 脉冲电场凝胶电泳的 DNA 样品的制备：
为避免大分子 DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌 (StapHylococcus aureus) 作为例子。
1) 取 100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于 4 ℃ ， 5000g 离心 5min 。
2) 用 20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心 5min 。之后用 10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。
3) 取 1.5mL 细胞样品与相同体积含 2%SeaPLaque 琼脂糖的 EC 缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于 4 ℃ 凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至 50 ℃ 。
4) 对于每一个菌株，需要 15 ～ 20 个凝胶块，将它们放至含有 30 ～ 45μg/mL RNase(50mL 的 10mg/mL 的 RNase) 的 10mL EC 缓冲液中，于 37 ℃ 振摇过夜。
5) 去掉裂解缓冲液，换为 10mL ESP 缓冲液于 50 ℃ 轻度振摇温育 48h 。
6) 将凝胶块放在 10mL 含有 174μg/mL 苯甲基磺酰氟 (PMSF) 的 TE 缓冲液中，室温温育 4h(2h 换液一次 ) ，以灭活 ESP 中的蛋白酶 K 。
7) 用 TE 清洗琼脂块 6h(2h 换液一次 ) ，置于 TE 中 4 ℃ 保存。
2 、 限制酶消化：
提高 PFGE 的分辨率取决于 100 ～ 1000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。
1)25μL10× 反应缓冲液， 30U 限制酶，加双蒸水至 250μL 混匀。
2) 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜 ( 按内切酶要求 ) 后，用 TE 缓冲液洗涤并贮存。
3 、 应用 PFGE 对样品 DNA 进行分析：
1) 用 0.5×TBE 缓冲液制备一个 0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用 Wide Minisub Cell 进行电泳的话， 50mL 该溶液即可。
2) 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。 ( 若样品在溶液中，以 l:1 的比率与 50 ℃ 2%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中 ) 。
3) 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先 14 ℃ 冷却。
4) 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速 (5 ～ 10mL/rain) 或打开变速泵至 40 。
5) 通过计算机启动极性转换程序。大于 50kb 的限制性片段在 1.2s 和 0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为 3.5h 或更长。小于 50kb 的限制性片段在 0.4s 正向和 0.2s 反向的电脉冲 ( 比率为 2:1) 下得以分离，时间为 3 ～ 5h 。
6) 在 0.5μg/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。
4 、 分离、纯化大的 DNA 片段：
1) 凝胶染色、分析后，在目的带前 ( 靠近正极处 ) 切一个 0.25cm2 左右的槽，注入 0.8%Seaplaque 琼脂糖，使之凝固。
2) 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测 DNA 的迁移，当目的带进入 Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至 1.5mL EP 管中。
3) 加入 2μL 的 tRNA ， 30μL 5mol/L NaCl ， 370μL 蒸馏水，在 65 ～ 70 ℃ 之间，化胶并保温 10min 。
4) 苯酚 / 氯仿 500μL 抽提两次。
5) 用 2.5 倍体积 95% 乙醇和 1/10 体积 NaAc(3mol/L ， pH5.2) 于 -70 ℃ 10min 沉淀水相。再用 70% 乙醇洗两次并将沉淀溶于 TE 缓冲液中。
【注意事项】
1 、 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。
2 、 PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。
3 、 用蛋白酶 K 包埋的材料时 50 ℃ 温育时间很长 (24 ～ 48h) ，有些学者提出如此长时间不必要 (Mortimer et al.1990) ，且可能造成高分子质量 DNA 降解。在实验中可视情况而定。
4 、 琼脂糖凝胶块在 TE(pH7.6) 中 4 ℃ 可存放数年，如在 0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。
5 、 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。
6 、 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为 14 ℃ ，需要一些冷却设备 ( 缓冲液冷却循环器或 MiniChiller) 。此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。 |
