生物知识

轮状病毒(rotavirus,RV)纯化方法,仅供参考

作者:www.bilong.com 来源:网络 发布时间: 2012-11-30 08:49  浏览次数:
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一、标本的采集和储存

出现症状后72小时内采样。
粪便量尽量不少于5ml。
贮存于2~8℃,但最多不能超过3天;长期贮存应在-20℃或-70℃。
成形便和肛拭子诊断意义较小。

二、所需材料

IDEIA™ norovirus试剂盒(DakoCytomation公司)
1000µl和200µl微量加样枪及相应不带滤芯的枪头
酶标仪
洗板机
吸水性能好的卫生纸
去离子水(无须高压)或蒸馏水
涡漩震荡器
离心机
50ml管、1.5ml EP管及相应的架子

三、检测前准备

将试剂和待检测标本置于室温(15~30℃)30min。
阴性对照:将1ml样品稀释液(sample diluent)加至标记好的小瓶中作为阴性对照。
阳性对照:1ml阳性对照液(positive control)溶解一瓶阳性对照, 颠倒混匀。未用完的阳性对照可在2~8℃贮存1个月,长期贮存应分装存于-20℃。
每次检测均至少一个阳性对照和一个阴性对照。
空白对照:空气
洗液的配制:1倍体积的洗液浓缩液(WASH BUFFER×25)加24倍体积的去离子水,当天用当天配。

四、标本准备

加入1ml样品稀释液至1.5ml 小离心管中,然后,加入0.1g固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本,置于漩涡震荡器充分混匀,室温静置10min,室温下≥5000rpm离心5min,取上清进行检测或置-20℃冰箱保存备用。

五、检测步骤

1、将需要数量的微孔板置于微孔板架上。

2、每孔加入100µl 10%便悬液以及阴性对照,阳性对照。

3、每孔加入2滴(或100µl)酶结合物(conjugate),用枪头轻柔混匀(上下5次左右),20~30℃静置60±5min。

4、每孔加入350µl洗液(用手轻微摇动1 min左右),弃去洗液,在卫生纸上拍干,共洗5次。

5、每孔加入2滴(或100µl)底物液(Substrate),20~30℃静置30min。待蓝色显现后迅速观察颜色。

6、每孔加入2滴(或100µl)终止液(Stop solution),充分混匀。

7、读取OD450值,打印输出或记录值。结果必须在加入终止液后30min内读取。

六、结果判定

阴性对照:肉眼观察无色或OD450值<0.15。

阳性对照:肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450值>0.50。

临界值(cut-off value):OD450值=阴性对照OD450值+0.10。

标本:

a)肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性,肉眼观察无色判定为阴性。

b)OD450值大于临界值判定为阳性,小于临界值判定为阴性,OD450值在临界值±0.01

范围内判定为可疑,应重复检测或重新取样。判断阴阳结果按上述方法进行。若OD450值在临界值仍在±0.01范围内,仍判定为可疑,对于可疑样品应用PCR方法来判定最终结果。

七、注意事项

1、便标本处理时震荡时应充分震荡,特别是成形便或稀便,以便于病毒从标本中释放出来。

2、加酶结合物(conjugate)后应用枪头轻柔混匀(上下5次左右),以便于抗原抗体充分结合。

3、读取吸光度应在加完终止液之后30min内完成。

4、所有标本和阳性对照必须被当作具有潜在感染性的物质进行处理。

5、打开后的96微孔板应置于可封口的有干燥剂的口袋中贮存于2~8℃,打开后6周内用完。

6、终止液中含0.46mol/L硫酸,避免接触到皮肤和眼睛。如果终止液接触到这些部位立即用水冲洗。

7、底物液避光保存,不使用已经变蓝的底物液。

8、避免试剂、金属离子、氧化性物质及微生物污染。

9、因标本中可能存在某些腺病毒,该病毒具有与眼结膜结合的能力,在检测过程中应避免手与眼的接触。

10、ELISA板微孔不能反复使用。
 

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