[转载]MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)(

作者：admin 来源：本站发布时间： 2013-06-17 22:48　浏览次数：

购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于2001年的毕特博生物 www.bitebo.com

LONZA 龙沙细胞培养基

1、治疗级无血清间质干细胞培养基

2、X-VIVO 限定化学成分无血清造血细胞培养基

3、ProCHO4 无蛋白CHO培养基

4、UltraDOMA无血清杂交瘤细胞培养基

5、UltraCHO无血清CHO细胞培养基

6、UltraCULTURE 无血清培养基

7、UltraDOMA-PF无蛋白杂交瘤细胞培养基

8、Insect-XPRESS无蛋白昆虫细胞培养基

9、UltraMEM 低血清培养基

10、UltraMDCK 限定化学成分无血清肾细胞培养基

11、Pro293限定化学成分无血清培养基

12、ProFreeze-CDM, NAO, 限定化学成分冻存培养基(2×)

13、PowerCHO限定化学成分无血清CHO培养基

14、ProNS0限定化学成分无蛋白质培养基

15、HL-1限定化学成分无血清培养基

16、PC-1限定化学成分无血清培养基

17、Lymphochrome 培养基

18、ProPer1限定化学成分无血清培养基

19、ProDoma无血清杂交瘤细胞培养基

20、ProVero 1无血清培养基

21、Cytogenetics Media细胞遗传学培养基

22、PERMEXCIS(TM) 病毒生产培养基（一种PER.C6培养基）

详情烦下载附件

2013 LONZA特殊无血清培养基

北京毕特博生物技术有限责任公司

http://www.bitebo.com
电话：010－82015225

400热线：400-833-9299
手机：13366202681 张钰

QQ：1050524889

传真：010-62015131

一：概述

microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。

以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程：

二：背景资料

检测人脑组织中miRNA的表达。所选的miRNA及其扩增长度信息如下：

	Primer ID	Mature_Acc	Mature_ID	PCR_SIZE
1	hsmq-0031_01	MIMAT0000069	has-miR-16	75
2	hsmq-0032_01	MIMAT0000422	hsa-miR-124	73
3	hsmq-0033_01	MIMAT0000443	hsa-miR-125a-5p	77
4	hsmq-0034_01	MIMAT0000423	hsa-miR-125b	75
5	hsmq-0035_01	MIMAT0000429	hsa-miR-137	76
6	hsmq-0036_01	MIMAT0000250	hsa-miR-139-5p	75
7	hsmq-0037_01	MIMAT0000437	hsa-miR-145	76
8	hsmq-0038_01	MIMAT0000450	hsa-miR-149	76
9	hsmq-0039_01	MIMAT0000439	hsa-miR-153	75
10	hsmq-0040_01	MIMAT0000452	hsa-miR-154	75
11	hsmq-0041_01	MIMAT0000259	hsa-miR-182	77
12	hsmq-0042_01	MIMAT0000261	hsa-miR-183	75
13	hsmq-0043_01	MIMAT0000458	hsa-miR-190	75
14	hsmq-0044_01	MIMAT0000276	hsa-miR-219-5p	74
15	hsmq-0045_01	MIMAT0000077	hsa-miR-22	75
16	hsmq-0046_01	MIMAT0000082	hsa-miR-26a	75
17	hsmq-0047_01	MIMAT0000100	hsa-miR-29b	76
18	hsmq-0048_01	MIMAT0000244	hsa-miR-30c	76
19	hsmq-0049_01	MIMAT0000441	hsa-miR-9	76
20	hsmq-0050_01	MIMAT0000689	hsa-miR-99b	75
21	hsnRNA-U6_01	M14486	hsnRNA-U6	81

三：实验内容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析。

四：实验主要仪器和试剂

主要实验仪器:冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System。

主要实验试剂:TRIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。

五：实验操作

前期准备:为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行Total RNA抽提。

1、样品处理:取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞。（Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为悬浮细胞，离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞）。

2、相分离:室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。

3、RNA沉淀:小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。

4、RNA洗涤:去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。

5、RNA溶解:风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。

6、RNA浓度测定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD260×稀释倍数）。

7、RNA电泳检测：
7.1 变性胶制备：取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。

7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops)：取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中。

7.3 RNA样品处理：取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳。

7.4 RNA电泳：先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。

8、RNA抽提结果:
8.1. RNA电泳图（取3ul RNA 样品）：

8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD ₂₆₀/OD_280。

RNA来源	RNA浓度(ng/ul )	OD ₂₆₀/OD₂₈₀
人脑组织	3470	1.9

9、miRNA 3’端进行加“Poly A”处理

融解加“PolyA”反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
PolyA Reaction 反应液的配制

在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL

试剂组分	体积	终浓度
Total RNA		2μg
2.5U/μLPolyA Polymerase	1μL	2.5U
10×PolyA Polymerase Buffer	2μL	1×
10×rATP Solution	2μL	1×
ddH2O(RNase/DNase free)	补至20μL

在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。
Total RNA使用量可在100ng～10μg之间调整，如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之间调整。

10、PolyA反应：

混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃。

11、Poly A化的RNA进行反转录反应：

融解反转录反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。RNA-Primer Mix 的配制反应：
在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL

试剂组分	体积	终浓度
PolyA反应液	2μL
25×Oligo dT Adaptor	1μL	1×
ddH2O(RNase/DNasfree)	10μL
Final Volume	13μL

混匀RNA-Primer Mix，短暂离心，直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。

配制反转录反应液：

在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。

试剂组分	体积	终浓度
RNA-Primer Mix	13μL
5×RT Reaction Buffer	5μL	1×
25mM dNTP	1μL	1mM
25U/μL RNase Inhibitor	1μL	25U
200U/μL M-MLV RTase (RNase H free)	1μL	200U
ddH2O(RNase/DNase free)	4μL
Final Volume	25μL

反转录反应:
混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。

12、qPCR 检测miRNA.

miRNA检测引物设计：miRNA qPCR Detection Kit 中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物：“Universal adaptor PCR Primer”，Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。因为miRNA序列长度一般都在18～24nt之间，所以其检测的 Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体，其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。

miRNA qPCR Forward Primer 设计举例（以小鼠mmu-miR-125b-5p为例）：
在miRNA Database中查找检测的miRNA序列，如下图所示：
miRNA Database：http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL

则其Forward 检测引物可为：

miRNA sequence	ucccugagacccuaacuuguga
Primer sequence	tccctgagaccctaacttgtga （Tm：58.8）

融解2×qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。冰上进行qPCR反应液的配制（所有miRNA进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No template control）测试）

试剂组分	体积	终浓度
2×qPCR Mix	10μL	1×
qPCR Forward Primer（2μM）	2μL	0.2μM
Universal Adaptor PCR （2μM）	2μL	0.2μM
1st strand cDNA（diluted 1:5）	2μL
ddH2O	4μL
Final Volume	20μL

1）2×qPCR Mix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。
2）Rox Reference Dye使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪，如ABI的定量PCR仪。
3）引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
4）1st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用，防止反转录体系对qPCR体系的影响。
5）充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。
6）qPCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）。

循环数	步骤	温度	时间	检测
1	预变性	95℃	10min	否
	变性	95℃	10sec	否
40	退火	57℃	20sec	否
	延伸	72℃	10sec	是

对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）

检测温度范围	升温速率	恒温时间	检测
70℃～95℃	0.5℃/次	6 sec/次	是
30℃		30sec	否

1）、2×qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。
2）、因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性，在检测时应严格控制退火温度，防止出现非特异性扩增。
3）、进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt，为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右（miRNA序列一般为22nt左右），所以延伸只需10sec即可。对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃～83℃范围内，如果超出此范围，建议使用别的方法来验证产物的特异性（如电泳）。

以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器，如使用的为不同公司的定量PCR仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。

六:结果分析

20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果

20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值

	Primer ID	Mature_ID	PCR_SIZE	组织	Sample Ave. Ct	胶泳道
1	hsmq-0031_01	has-miR-16	75	脑	27.02	1
2	hsmq-0032_01	hsa-miR-124	73	脑	22.98	2
3	hsmq-0033_01	hsa-miR-125a-5p	77	脑	27.81	3
4	hsmq-0034_01	hsa-miR-125b	75	脑	22.58	4
5	hsmq-0035_01	hsa-miR-137	76	脑	28.51	5
6	hsmq-0036_01	hsa-miR-139-5p	75	脑	30.66	6
7	hsmq-0037_01	hsa-miR-145	76	脑	24.7	7
8	hsmq-0038_01	hsa-miR-149	76	脑	29.71	8
9	hsmq-0039_01	hsa-miR-153	75	脑	27.61	9
10	hsmq-0040_01	hsa-miR-154	75	脑	30.39	10
11	hsmq-0041_01	hsa-miR-182	77	脑	34.64	11
12	hsmq-0042_01	hsa-miR-183	75	脑	33.86	12
13	hsmq-0043_01	hsa-miR-190	75	脑	32.28	13
14	hsmq-0044_01	hsa-miR-219-5p	74	脑	28.16	14
15	hsmq-0045_01	hsa-miR-22	75	脑	24.09	15
16	hsmq-0046_01	hsa-miR-26a	75	脑	22.66	16
17	hsmq-0047_01	hsa-miR-29b	76	脑	26.72	17
18	hsmq-0048_01	hsa-miR-30c	76	脑	26.54	18
19	hsmq-0049_01	hsa-miR-9	76	脑	23.11	19
20	hsmq-0050_01	hsa-miR-99b	75	脑	27.06	20
21	hsnRNA-U6_01	M14486	81	脑	22.26	21

原文地址：MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)作者：阮阮

产品定购及咨询，请联系毕特博生物

北京毕特博生物技术有限责任公司

电话：010－82015225

400热线：400-833-9299
手机：13366202681 张钰

QQ：1050524889

传真：010-62015131

购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于2001年的毕特博生物 www.bitebo.com

分享到