（二）成纤维细胞排除法
1．机械刮除法：
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：
（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止
2．反复贴壁法：
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
4．胶原酶消化法：
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
5．其它方法：
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心 10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
（三）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施
根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况：
完全无细胞游出或移动；
有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；
有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；
传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。
以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。
1．适宜底物：
把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
2．生长因子：
应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。
为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞（干细胞）的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。
3.动物体媒介培养方法：
（1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1～3毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块；
（2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织；
（3）进行体外培养。
（4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。
肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。
（四）体外培养肿瘤细胞生物学检测
一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明：
所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。
【形态观察】主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
【细胞核型分析】检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
【凝集试验】检测凝集力。
【软琼脂培养】检测集落形成能力。
【异体动物接种】向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。
【其它】除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。
在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为：异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测，这些项目将在本书第二篇中介绍。
（五）对肿瘤细胞系或细胞株的评价
已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。已如前述，癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去，凡已长期传代的细胞系，都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不死性；因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍完全相同（包括不死性）。据上述对用癌细胞系所获实验结果应尽量做分析性的结论，避免做概括性的与体内等同的结论，外推与体内等同更是不妥的。广泛来说，应用各种较长时间培养细胞做实验时，都应如此。