消化法原代培养兔胸主动脉平滑肌细胞

用DMEM配0.2%的1型胶原酶（用20的血清的DMEM配可能更好，有类似文献），分装于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主动脉置于1 瓶消化液中消化，消化约10几个小时（消化程度的把握要体会），离心后，接种（若见细胞量大，成功把握大），绝对静置3天（没必要看，看多了无益），8天可传代。

犬胸主动脉平滑肌贴块法—— 方法成熟，比消化法好控制的多。

1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，不然先天不足；

2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪；

3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm2培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻；

4、贴块无内膜外膜面之分，亦无需刮除内膜，若内膜面向下，会有少量内皮细胞爬出组织块，但只要平滑肌细胞一旦爬出来，内皮细胞生长自然不占优势，会因为平滑肌细胞大量爬出、增殖而漂起来，换液可洗掉，另外传代可纯化平滑肌细胞。

5、培液Gibco的 DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20%。

建议用1次性培养瓶，成功机会大于玻璃瓶。成功后再小心过度成玻璃瓶。块愈小愈好。用新刀，快，损伤小。全过程越短越好。组织块的边缘不齐整也不是什么很关键的问题，最重要的是组织块要尽量小，尽量能剪成小米粒大小；另外就是组织块要贴牢，其关键就是培养液可以在6小时后翻瓶的时间再加，这样就可以避免组织块贴不牢而悬浮起来的尴尬了。

人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察

1.标本采集　在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带， 挤出脐带血管中的血液，放入装有含青链霉素的PBS液瓶中，2h之内行脐静脉内皮细胞培养。

双抗：青霉素100u/ml; 链霉素100μl/ml

PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸馏水中加入上述质量物质，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟，室温保存。

2.原代血管内皮细胞的获取与培养　按Jaffe等人〔1〕的方法加以改进。在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃ PBS，冲洗两次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50ml锥形离心管中，加入小牛血清2ml终止酶反应。再以30ml PBS冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000r/min离心10min，弃上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)？]培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1ml细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1×105/ml 接种至24孔培养板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃静止培养24h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2d换液1 次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。

胰蛋白酶溶液（100ml）配制：

1）将D-Hanks（橙红色）液高压消毒灭菌，用NaHCO3液调节pH至7.2左右。

2）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。

3）次日先用滤纸粗虑，再过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱或－20℃保存备用，常用浓度为0.25%或0.125%；胰蛋白酶溶液（深红色）偏酸，使用前用NaHCO3调pH至7.2左右。

D－Hanks液配制：KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚红0.02 g/L

3．传代内皮细胞的培养　原代内皮细胞融合后用培养液冲洗两次，然后用0.25%胰酶加入到内皮细胞中，每孔0.3ml。边消化边在倒置显微镜下观察。细胞皱缩、彼此分离或呈大片状分离即可终止消化。加入含有10%小牛血清的培养液，吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按105个细胞/ml，继续培养。

4．血管内皮细胞的鉴定

1）倒置显微镜观察细胞的形态特点。

2）VWF相关抗原免疫荧光检查：在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，每孔中种植1ml含有 105个细胞的原代或传代内皮细胞悬液。待内皮细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗3次，投入冷丙酮中 (-18～-20℃)，细胞面向上，作用7min，用PBS冲洗3次，每次1min，而后进行间接免疫荧光检查，第一抗体为鼠抗人VWF单克隆抗体(苏州医学院血栓室提供)，1∶20倍稀释，加入50μl于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜。同时不加一抗做阴性对照。用PBS冲洗3次后，加入异硫氢酸标记的二抗50μl(异硫氰酸标记羊抗鼠IgG，北京)，放入37℃2h后，用PBS洗涤3次。然后立即在荧光显微镜下观察，摄片。 血管内皮细胞鉴定结果：　VWF相关抗原间接免疫荧光检查，原代及传代培养的内皮细胞浆中有黄绿色的荧光着色，胞核呈黑绿色，整个细胞轮廓清楚。作为对照的内皮细胞片子中，偶见绿色斑点散发荧光，未见细胞轮廓。

5．内皮细胞体外生长情况　 用胰蛋白酶消化的人脐静脉内皮细胞，接种在24孔塑料培养板各孔内4h后，大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、呈团状，少数细胞伸展，48～72h 生长最快，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有旋祸状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。于 3～4d后融合，7～10d胞体呈多角形，相互嵌合，为单层呈铺路石状排列。

人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验（刘　金）

血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程，在免疫调节，移植排斥，肿瘤转移，炎症等许多过程中也具有重要作用。内皮细胞培养是体外研究内皮细胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了内皮细胞分离及体外培养的方法。人脐带静脉是人血管内皮细胞最易获取的来源，在人内皮细胞的研究中被普遍采用。

㈠ 原理

在体外，内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖，并可传代，可作为内皮细胞增殖，细胞因子分泌、表型等研究的模型。

㈡ 方法

1. 脐带内皮细胞的分离

试剂与器材

（1）胶原酶(Sigma)：I型 ((C-0130),用无血清RPMI 1640配成0.1%(W/V),分装、-20℃保存。

0.1％明胶：称取明胶，用三蒸水配成0.2％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，过滤，放4℃备用。(即用过滤法消毒)

（2）Cord Buffor

肝星状细胞培养

材料

相差显微镜，荧光显微镜，手术器械，雄性SD大鼠，体重250-450 g，戊巴比妥钠，200目尼龙网，小牛血清（或胎牛血清，则更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D- Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红 0.02 g/L），HBSS，台盼兰等。

方法

大鼠腹腔麻醉--<剖腹 --<门静脉插管--

传代方法：弃培液--<以D- Hanks'液洗两次--<0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化--<镜下观察细胞突起回缩（2-5分钟左右）--<以完全培液（DMEM+10% NBS）终止反应（若不用EDTA，可以不需离心）--<吹打，1:2-1:3接种，然后继续培养（5% CO2，37度）。

结果

次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。

讨论

进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin和alpha-SMA；后者在细胞激活后才表达。也采用过无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！

参考文献

袁桃霞，张锦生，张月娥，等. 大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学学报 1996;23(2):90-93。

乳鼠心肌细胞培养方法详述

一．材料

所需液体：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

试剂 Trypsin, SDS, DMEM 均购于 Sigma Chemical Co.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司，其余均为国产分析纯。

取鼠：标准SD大鼠，鼠盆用棉铺好，取鼠。

物品：白大衣、饭盒

小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）

瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]

250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]

500ml烧杯1个，用作废液缸。

50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）

三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）

离心管及帽（12-14个），两个试管

吸管 （5~8个）大镊子 （两把，持物，例夹棉球等）

台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个 500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用 2个、微量加样器1000ml及500ml

以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。

二．培养方法：

事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

具体方法为：

1. 把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入 0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。

2. 取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。

3．用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶，然后将其中少许放入50ml的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。

4．把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35℃）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。一定要注意监控。

5．温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升

6．10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2ml上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。

7．接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，打开关。

8．同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。

9．取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。

10．消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。

11．离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。

12．取出24孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。

（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液时每孔加1~1.5ml）

三．讨论

乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，我们在试验中摸索到0.06％浓度的胰酶对细胞损害较小，比起一些文献记载的0.15％浓度有一定的优越性，但这个浓度消化所需时间较长，所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1 h, 除去成纤维细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别[1]。

心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在一天左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好，DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充[2]。

四．参考文献

1.Wang HX, Zhang WM, Sheng JZ, Wong TM. High carbachol increases the electrically induced [Ca2+]I transient in the single isolated ventricular myocyte of rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997；319：91-9

2.Animal cell culture methods edited by Jennie P.Mather and David Barnes.--California:Academic Press,c1998.--xiv,368p.24cmSBN0124800408:CNY619.26

原代胚胎成纤维细胞培养

一、实验器材：手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平 皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、实验试剂：无Ca+2和Mg+2的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。

三、实验动物：孕期14至16天的孕鼠

四、实验步骤：

1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。

3.用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4.将上层细胞悬液倒入一装有 10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。30ML　MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。

5.细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。

6.3×106细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。

7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8.细胞长满后，先用PBS冲洗，倒掉，加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1：5传代。

9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存。（冻存液要现配）

五、讨论

1.原代培养，一定要避免污染。

2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。

3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。

4. 消化细胞时间不要过长。

大鼠皮层神经元原代培养

液体配制：

硼酸硼砂缓冲液：0.05M四硼化钠45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4；

胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡盐液定容至100ml

所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干备用。

操作步骤如下：

1. 孕16d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2.在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液（DMEM＋10％FBS）的离心管内终止消化液作用5min。

4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5. 将所收集的上清经200目筛网过滤。

6.过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋20％FBS）并吹打成单细胞悬液。

7. 细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内，放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara- C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

『注意以下几点』

1.上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125－0.25的胰酶消化15－20min左右，也可用DNA酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。

2.上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择 孕13d 左右的小鼠。

3.神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够！！

4.在玻片上培养神经元时，一定要注意玻片的来源和处理方法，这个非常重要，对神经细胞的影响是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话，那么您在以后的培养中最好还是用同一来源（厂家）的玻片。

5.如果有B27和neurobasal培养基，那么就方便了（不用加AraC）－－

1）把细胞悬液用（DMEM＋20％FBS）悬浮，种到培养皿上6－12h后，全量换成2％B27的neurobasal培养基，继续培养，3d半量换液。

2）把细胞悬液用直接用2％B27的neurobasal培养基悬浮接种。

3）可以用新生1d内的胎鼠皮层直接培养。

胶质细胞培养（astrocyte, oligodendrocyte）

取材及胶质细胞的混合培养

1.P2 SD大鼠经低温麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。

2. 剪碎组织成1mm3大小，加入胰酶 -EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的离心管内终止消化液作用5min。

4. 吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5.所得上清于800r/min离心 5min，弃上清，管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入25cm2培养瓶，放入孵箱培养。以后每隔2～3d进行全量换液。

摇床振摇分离星形胶质细胞和寡突胶质细胞

培养至7～10天，换液后放入孵箱继续培养24h，取出拧紧培养瓶盖，于37℃恒温摇床上280r/min摇动18h。此时寡突胶质细胞90％以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。

分离培养悬液内的寡突胶质细胞

吸出悬液至离心管内950r/min离心 10min，弃上清后管内加入新鲜GM，吹打成单细胞悬液，按1.5×105/cm2种入预先用 100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。24h后换成DF12＋N2的无血清培养液，此后每三天半量换液1次。

瓶底星形胶质细胞的继续培养

25cm2培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks液洗2次后常规传代，以1.5×105/cm2种入预先用100μg/L 多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。培养液为GM，每三天半量换液1次。

动脉粥样硬化患者VSMC的提取

实验材料：眼科剪刀1把 眼科镊子2把 1×PBS约200ml M199培养液 离心机 5ml小皿 10ml大皿

实验步骤：

1.在超净台内用10ml的离心管分装5ml的1×PBS（已高压灭菌）。

2.手术台上取患者发生动脉粥样硬化改变的病变动脉，分放入准备好的PBS中，拿回实验室在超净台中，无菌条件下剥去外膜，用手术刀片刮去内膜，留下中膜并将其剪成1×1mm大小组织块。

3.消化法：PBS清洗组织块后并将其转移入10ml的离心管，加入0.125％胰酶消化37℃30分钟，室温吹打100分钟或者振荡器振荡100分钟，待组织块变小且消化液变粘时，收集消化液配平以1500转/分钟离心10分钟后，收集细胞种植于预先加入M199培养液的 5ml小皿中放入37度5％CO2的培养箱中。

4.贴块法：PBS清洗组织块后移入已准备好的10ml大皿中，块间距为0.5cm，放入37度5％CO2的培养箱中，3小时后，待组织块贴壁后，再加入2ml培养液后放回37度5％CO2的培养箱中。注意：最后加入2ml培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下，勿使组织块吹下。

5.随后每3天予以半量换液。

6.一周后可见组织块周围有细胞爬出，大约3周后80%融合。因本人系非细胞生物学专业人员，本细胞培养时间又很短，多次进行细胞传代未成功，还望有经验的专家指点。

膀胱平滑肌细胞细胞原代培养

1.麻醉后消毒，下腹正中切口于膀胱颈（结扎处远端约1~2cm）

2.严格无菌操作取出标本、手术台位于超净台旁

3.在超净台，40u/ml庆大霉素溶液中浸泡5分钟

4.生理盐水漂洗1次

5.D－hanks液漂洗1次

6.放入D－hanks液中，除去粘膜、粘膜下及浆膜

如果是Shame组兔，以10ml注射器抽取约8ml D－hanks液，于粘膜层下注射起泡后，剪去粘膜层，直接剪取平滑肌组织，弃浆膜层及其上未剪下之肌组织。

new: 如果是不全BOO兔，则可将膀胱剪成宽约0.5cm之条状，撕去粘膜层后，助手以一眼科镊将该组织一端固定，眼科镊与该组织垂直，并夹持整个横截面，术者同法夹持于附近，助手持第3把眼科镊提起肌组织，术者以手术刀锐性分离肌层；如此，向另一端推进，锐性分离肌条。

7.在超净台，取相当于0.5为X0.5 CM2肌块，室温下将其剪碎成1~2mm碎组织块

8.转移入离心管

9.加入D－hanks液(操作成功)　 OR　Dulbecco

10.离心1000转/min，10分钟 离心半径13cm，弃上清

11.加入I型胶原酶（2mg/ml） 5mg,(II型胶原酶2mg/ml 5mg也可，但效果不如I型胶原酶)

12.不要加入DMEM为主要成分的培养液(否则胰蛋白酶失活)

13.转移入培养瓶中

14.4度下过夜孵育。

15.加0.25%胰蛋白酶

16.36.5度振荡消化 15~30min,弃上清。(可省)

17.200目(74um)不锈钢网过滤。(可省)

18.转移入离心管,吹打后待可见物沉淀，吸尽沉淀（避免组织块培养法）

19.离心1000转/min，10分钟 离心半径13cm，弃上清

20.加培养液至10ml(ok)

21.转移入培养瓶中

22.CO2恒温箱中培养

23.12h后收集未贴壁细胞并计数

家兔椎间盘(intervertebral disc )细胞的体外培养方法

Material and method：

Material :

1. 培养皿、培养瓶、烧瓶、试管等。

2. 分离组织需要的眼科剪子、眼科镊子。

3. 5%CO2孵箱、PH计、95%氧气源。

4. 36电动恒温水浴。

5. 培养液、各种缓冲液及添加剂DMEM高糖培养基、Hank’s缓冲液 、20%胎牛血清，转换生长因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰岛素-转铁蛋白-硒（10ug/mL胰岛素，5ug/mL转铁蛋白，和0.5ng /mL亚硒酸盐）青霉素100U/Ml，链霉素100U/ml 。

6. 消化液 胶原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%台盼兰、0.25胰蛋白酶

Method 1 组织块法

1. 取材：空气栓塞法处死家兔后，在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM培养基（含双抗）。迅速带回到无菌超净台上。（注意事项：椎间盘位于相邻两个椎体之间，取材过程较为繁琐，要求动作迅速，争取在家兔死后半小时内完成，否则，该组织对缺氧耐受性差导致培养失败）。

2. 剪切：在超净台上，进一步将周围组织分离，用Hank’s液冲洗数遍，直到冲洗液透明为止。眼科剪刀将组织修剪为1~2cm3大小的小组织块，Hank’s冲洗干净。 加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小，否则不容易爬出足够数量的细胞)

3. 接种：用吸管吸取小组织块入培养瓶底部，摆放均匀，一个25cm2的培养瓶可放置10-15个小组织块，翻转培养瓶，加入少量培养液。4~6小时后，待组织块充分贴壁后，再翻转回来（动作一定要轻巧，以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底）

4. 置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细胞95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。

Method 2 消化法

前面步骤同组织块法1，2。

3.组织块再进一步剪切，此时培养液中最好不加血清。完毕后，加入消化液，移入到10ml 离心管，培养箱内消化。每隔20分钟，用吸管吹打一次，观察液体有否变浑浊，并取少量液体，在相差倒置显微镜下观察。0.4%台盼兰染色计算活细胞数目。接种密度在105数量级。置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细胞95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。

鸭胚成纤维细胞原代培养

1．材料

1.1 10-12日龄非免疫受精鸭胚 购于雅安偏远山区

1.2标准胎牛血清(FBS) Tianjin.h"y bio.co;ltd

1.3MEM营养液（细胞增殖液；细胞维持液；洗液） GIBCO Invitrogen Corporation

1.410倍胰酶 （自配）

1.5抗生素 医用80万单位青霉素和医用100万单位链霉素

1.6灭菌的无钙、镁平衡盐溶液（自配）

2．实验器材与仪器

2.1实验器材

国产玻璃螺旋口细胞培养瓶（100ml）；培养皿；离心管（10ml）移液管（10ml与1ml）；漏斗；10层纱布；三角锥瓶（100ml）；吸耳；酒精灯；酒精（75%）；碘酒(3%)；火柴；瓶塞；镊子；滤器及配套滤膜（25mm直径 孔径0.22um）；50ml注射器；烧杯；蛋座；记号笔；离心管架；金属饭盒；照蛋器。

2.2 实验仪器

仪器名称 产地

超纯水仪 Water pro ps.labconco

电子天平 ShangpingFA2004. 上海天平仪器厂

高压灭菌仪 HIRAYAMA4

双蒸水仪 上海亚荣生化仪器厂

Orion台式PH测试仪 868型 OrionResearch.Inc

倒置显微镜 OLYMPUS

细胞培养箱 Queue

台式高速低温离心机 Beckman coultertm

超净台 苏州安泰空气技术有限公司

水浴锅 国华电器有限公司

低温冰箱 海尔集团

电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9140型上海精宏实验设备有限公司

3.4 原代鸭胚成纤维细胞的制备。（10×ATV消化法）

实验前，无菌室用紫外线照射30min以上；超净台使用前应彻底擦干再用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）擦拭一遍 。双手和瓶子表面用75%的酒精消毒。(以下步骤参考文献[2][4][5][6]进行的)

①取10-12日龄发育良好的鸭胚，气室向上置于蛋盘内，用碘酒擦拭鸭蛋表面，后用酒精脱碘，并在气室端打一小孔，沿气室用镊子小心剪去蛋壳露出气囊，以镊子去除覆盖于绒毛尿囊摸上的白膜，暴露出尿囊膜及附着的血管。用镊子撕开尿囊膜，夹住鸭胚颈部，移置于一小培养皿中。

②去除胚的头，四肢和内脏，用基础营养液清洗2-3次，直至组织出现透明，倒尽清洗液。

③用眼科剪剪碎胚体直至0.1-0.5立方毫米 。剪越碎越好。

④移组织碎块于三角锥瓶内，加0.2ml/胚 的10×ATV 37℃水浴锅内温 热消化 2min，后用吸管移至离心管中,用离心机5000rpm 离心5min弃上清液。

⑤加入含双抗的10%血清的基础营养液，移离心管下层组织碎块于三角锥瓶内，由于分散的细胞在没有胰蛋白酶的作用下，会很快聚合成小团，为减少细胞成团应不断吹打，直至成细胞全部分散开。

⑥取灭菌纱布叠成8-10层置于漏斗上并使中部略凹陷，以含双抗的10%的基础营养液润湿纱布，将已吹散的细胞悬液经纱布过滤除杂。

⑦过滤后的细胞悬液补加含有双抗的10%血清的基础营养液，按10ml装入细胞培养瓶（容量为150ml的细胞瓶），将细胞瓶置于37℃细胞培养箱内静置培养 。2小时后观察细胞贴壁情况，24小时后确认无污染。一般情况，24小时后细胞可基本长成单层。

猪甲状腺细胞原代培养方法

1. 材料

猪甲状腺由锦州市屠宰场提供。F-12培养基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；胶原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH（sigma公司）

2. 方法

杀猪后迅速取出甲状腺1～2个，置于盛有75％酒精的烧杯中，用冰盒送至实验室（1小时以内）。立即置于pH为7.4的PBS缓冲液（含青链霉素）中，反复漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及结缔组织，用眼科剪子、镊子将甲状腺组织剪成１mm3大小的碎块。置含0.25％胰酶和300U/ml胶原酶的容器中，放于37℃温箱中消化60min，每隔15min需摇动一次。用吸管将上清液的三分之二吸入离心管中，并加入含有胎牛血清的培养基终止消化。以 1000转／分钟离心10分钟后，弃上清。将细胞沉淀用F-12培养基制成细胞悬液，充分吹打并用不锈钢网（200目）过目，再1000转／分离心10分钟，弃上清。沉淀悬于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培养基中，台盼蓝染色证明活细胞数大于95%，调整细胞浓度接种于培养板中（１ml／孔）。置于37℃的5%CO2孵箱中，每二至三天换一次液，至细胞融合成片后用于实验。

3.结果

猪甲状腺细胞培养24小时，镜下细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。

4.讨论

胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织如上皮组织、肝、肾等，对传代细胞也非常好。但消化纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胶原酶对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法，用单一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲状腺激素（TSH）是培养甲状腺细胞必备的，它能够起到促进甲状腺细胞生长的作用。本人也曾尝试过不加TSH，与加TSH对比明显可见细胞增长较慢，且形态不好。

细胞原代培养

材料：小鼠

器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器

试剂：DMEM（含血清）、无血清 DMEM培养基、胶原酶、PBS

准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

操作步骤：

1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡 2-3秒钟，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、睾丸或卵巢，置于盛有PBS的平皿中。

2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物, 转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。

4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胶原酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。

6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。

8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

心肌细胞的分离及培养

器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒

溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶

动物：小鼠

准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。

培养过程：

1. 两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精&5min，用小剪子及小镊子开胸取心。

2. 取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。

3. PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。

4. 放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。

5. 再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。

6. 重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。

7. 将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。

8. 加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。

9. 培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。

10.显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。

11.4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。

肝细胞原代培养

材料：小鼠

器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器

易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS

准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

操作步骤：

1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。

4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。

6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7、 1000rpm，离心5分钟，弃上清液。

8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

大鼠胰岛细胞原代培养

一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于 75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D- Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的 0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化 10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌 D-Hanks悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞。

视神经少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定

1 材料和方法

1.1 DMEM/F12条件培养液（亚硒酸钠40μg·L-1，腐胺16.2 mg·L-1，转铁蛋白100 mg·L-1，胰岛素234U·L-1，甲状腺素0.4μg·L-1，黄体酮0.62 mg·L-1，谷氨酰胺3g·L-1）。DMEM/F12培养基、小牛血清购自Hyclone公司，兔抗鼠GC抗体、亚硒酸钠、腐胺等购自Sigma公司。

1.2 视神经胶质细胞的来源、培养 取新生2d的Wistar大鼠10只（第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心提供），无菌条件下取出双侧视神经。接种至24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上。而后加入含30g·L-1小牛血清的DMEM/F12培养基，37(C，50mL·L-1 CO2，100%湿度连续培养3d。3d后弃废液，改为含5g·L-1小牛血清DMEM/F12条件培养液继续培养。每周换液2次。在获得足够的细胞数量后，改用无血清条件培养液继续培养，每2d换液一次。

1.3 形态学观察 每天在倒置显微镜（日本Olympus），观察培养细胞的生长过程和形态学变化并拍照。

1.4 免疫细胞化学鉴定：将含细胞盖玻片取出，0.01mol·L-1 PBS冲洗3次×5min；冷丙酮固定10 min；PBS冲洗（3次×5min）；30g·L-1过氧化氢室温孵育15min；PBS冲洗3次×5min；滴加正常山羊血清，室温孵育20 min；滴加1:100 GC抗体，阴性对照以PBS代替一抗，37(C孵育60min；PBS冲洗3次×5min；滴加生物素标记羊抗兔IgG，37(C，20min；PBS冲洗3次×5min；滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液；DAB工作液（武汉博士德公司）显色，自来水终止反应；脱水，透明，D·P·X封片保存。

2 结果

2.1 形态学观察结果

组织块24ｈ开始贴壁，48～72ｈ可见神经组织边缘游出少量细胞，主要为圆形或梭形（图1）。8～9d左右，细胞基本铺满培养孔。此时改用无血清条件培养基培养进行纯化。培养过程中，部分细胞死亡。12d左右获得的细胞胞体基本为呈圆形或多角型，直径约6～10μm。细胞核较大，胞质少（图2）。

2.2 免疫组织化学染色结果

培养的视神经少突胶质细胞的免疫组织化学染色GC蛋白阳性，未加一抗的呈阴性。染色结果显示成熟的少突胶质细胞突起丰富，互相形成蜘蛛网状（图3）。苏木素复染，异质细胞较少，90%以上为阳性细胞.

3 讨论

抑制神经再生基因Nogo的发现为视神经损伤的修复、视功能保护研究带来了希望。视神经胶质细胞包括星形胶质细胞和少突胶质细胞2种类型,分化不同,功能各异。成熟的少突胶质细胞不再具有分裂增殖能力，为分裂终期细胞[2]，培养较为困难。

1980年 McCarthy[3]等建立了从脑灰质组织分离、纯化星形胶质细胞和少突胶质细胞的分离培养模型。目前国内外多采用该法[4]。利用少突胶质细胞和星形胶质细胞贴壁能力的不同采用振动分离法进行分离、培养。此法主要用来获取星形胶质细胞，获得的少突胶质细胞较少。存在着操作步骤多容易被污染、分离过程中因振荡离心易造成机械性损伤导致细胞死亡等缺点。

本实验采用视神经组织块培养的方法，对新生大鼠的视神经胶质细胞进行条件化原代培养，利用少突胶质细胞和星形胶质细胞生长条件的不同，采用条件培养基纯化2种细胞。少突胶质细胞和Ⅱ型星形胶质细胞是从一种普通双潜能的少突胶质细胞－2型星形胶质细胞祖细胞（oligodendrocyte-type-2astrocyte progenitor cell，O2A）发育而来[2]。大鼠出生后约1周，少突胶质细胞逐渐成熟。因此，从新生大鼠取材可获得O2A祖细胞。体外研究发现甲状腺素、胰岛素、转铁蛋白、腐胺、黄体酮和微量元素硒等，可使O2A祖细胞朝少突胶质细胞定向分化。而血清等可以诱导O2A祖细胞分化为Ⅱ型星形胶质细胞[2、5]。我们利用这一特点，逐步减少条件培养基中的血清浓度，促进O2A祖细胞向少突胶质细胞分化。最终采用无血清条件培养基，抑制星形胶质细胞及其它异质细胞增殖，而少突胶质细胞在此条件下则基本不受影响。GC是表达于少突胶质细胞膜以及髓鞘的一种主要类脂，它是识别少突胶质细胞普遍应用的特异性化学标志物[2、 4]。免疫染色鉴定结果表明纯度较高超过90％。此方法简便、可靠、易于推广，便于对少突胶质细胞相关课题进行研究。

软骨细胞培养

软骨细胞的原代培养

龄新西兰乳兔(雌雄不限，共18只，分6次处理),溺死，置于75%酒精溶液中10分钟，拿入超净工作台，自眼外眦至耳屏前剪开皮肤暴露皮下组织，再次严格消毒，自外眦外将颧弓由根部剪断，暴露髁状突，去净髁状突表面软组织及软骨膜，以眼科剪剪取髁状突表面的透明软骨，以磷酸缓冲液（PBS含青霉素、链霉素各100U/L）冲洗2遍，将软骨剪切成1－3mm3 左右碎块，0.25%胰蛋白酶先消化 30-35分钟，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培养瓶，加0.1%Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min。直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，细胞悬液以1200r/min离心7分钟，弃上清，以含10％新生牛血清DMEM的培养液终止消化，离心弃上清以洗去细胞表面的酶，悬浮细胞并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％。将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5%CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。2天后换液1次，以后隔天更换培养液，倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况。待细胞贴壁达到85%－90%后传代。

软骨细胞的传代培养

待细胞贴满壁后传代。传代时,吸干培养液,用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25%胰蛋白酶－0.01%EDTA（1比1）消化液,以覆满瓶底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2 mL 左右含血清的培养液终止消化,收集第1代培养细胞，用弯头吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养瓶底壁脱落,收集细胞混和液, 1200r/min离心7分钟, 弃上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗细胞3次,制成细胞悬液，将细胞以2×105/ml 接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5%CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。隔天更换DMEM培养液。以第3代软骨细胞制成细胞悬液并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90%，调整细胞浓度为5×107/ml, 用于实验。

传代　吸干培养液,用PBS 液轻洗细胞2次,培养皿内加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆满皿底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大,少部分细胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养皿底壁脱落,收集细胞混和液,离心,用PBS 液漂洗2 次,再制成细胞悬液,计数,检查细胞活力,按每个培养皿接种2 ×105 个细胞再培养。

兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定

一、摘要 目的：建立兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定的方法。方法：成年新西兰白兔两只（正常及梗阻各一只），采用酶法分离技术获得膀胱平滑肌细胞后于10%小牛血清的DMEM中培养，观察细胞形态和扩增情况，用爬片染色、电镜、蛋白质α-肌动蛋白（α-actin）鉴定细胞类型。结果：倒置显微镜下观察均呈 “谷和峰”样结构、细胞爬片HE染色及电镜检查均证实为平滑肌细胞。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测 α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。结论：该方法易行、可靠、在短期内可获得大量高纯度膀胱平滑肌细胞。

二、 材料及方法

1、 试剂及标本

成年同龄雄性新西兰白兔2只，体重约2.5~3k(购于南京军区南京总医院动物实验中心)，一只为正常成年雄性新西兰白兔，一只为膀胱出口不全梗阻8周成年雄性新西兰白兔。DMEM、Ⅱ型胶原酶及α-肌动蛋白抗体（α-actin）购于北京华美公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；胰蛋白酶购于南京生兴公司。

2、 膀胱平滑肌细胞酶法分离

肌注盐酸氯胺酮200mg及氟哌利多 5mg麻醉，待兔进入麻醉状态后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱组织。超净台内依次庆大霉素溶液（浓度为100单位/毫升）、生理盐水及D-Hanks 液中浸泡洗涤5分钟，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及浆膜层。肌肉剪成肉糜后0.1%胶原酶（Ⅱ型2mg/ml）溶液40过夜消化（约 10-12小时）。然后加0.25%胰蛋白酶370消化30分钟，消化液变混浊呈絮状提示消化良好。用100目细胞筛过滤该絮状液，混悬液离心（1000 转/分，离心半径13cm）5分钟，沉淀的细胞移入培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50ml/L CO2、37度饱和湿度孵育箱中静置培养，培养液每周更换2-3次。

3、 传代培养

待培养的细胞通过增殖达到约80%汇合状态时做传代处理。弃去原培养瓶中的旧培养液，加入适量的PBS(因培养液中的胎牛血清对胰蛋白酶有抑制作用)，轻轻摇动，清洗残留的培养液后弃之。加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞，将培养瓶放置于CO2培养箱，不时在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大后，吸出消化液，并向培养瓶中加入含10%胎牛血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。细胞进行计数后，按照1X105~106密度将细胞接种于培养瓶中。

4、 培养细胞的观察及鉴定

采用倒置显微镜观察平滑肌细胞的形态及生长情况。细胞爬片HE染色观察细胞形态。电镜检查。免疫组化染色检测α-actin。

结果

两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构（图1 对照组2周的细胞；图2 实验组培养2周的细胞）。细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型(见图3)。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构（图4分离后培养细胞的电镜检查发现平滑肌细胞致密班结构）。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应（图5）。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α- actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。

三、 讨论

平滑肌细胞的培养方法可分为两类：组织块法和酶消化法。组织块法适用于细嫩、易碎的组织；其方法较简单；但容易产生杂质如成纤维细胞等，成纤维细胞生长快，故培养之细胞质量较差；培养的大多数细胞无收缩性；且原代细胞的获得需3~4周，获得大量平滑肌细胞耗时长（17）。既往酶消化法较组织块法复杂、精细；适宜的酶浓度和培养时间的确定较为困难；然而在较短时间内可获得大量的平滑肌细胞，1996年有学者报道（Chambers（18）等）酶消化法纯度为 70%。可见一种快速、高效、高纯度的酶消化法培养膀胱平滑肌的方法显得尤为重要。

本实验研究两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构。细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎 99%（在以下的膀胱平滑肌细胞的共聚焦检测中也证实了这一点）。 膀胱平滑肌的鉴定（10）主要根据其细胞形态及α-actin的检测。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构；细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型；电镜检查可见平滑肌细胞密班结构，这些细胞形态学的检测均证实其为膀胱平滑肌细胞。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应更进一步证实了该方法所获得的细胞为膀胱平滑肌细胞。已有学者通过实验发现：酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞细胞膜通道的密度有所下降；细胞膜电位和细胞膜电阻稍微降低。他们认为通过酶消化法所获得的膀胱平滑肌细胞经培养、传代后仍基本保持着原有的电生理特性，由此在体外研究的结果可较好的反映体内情况（21）（20）。梗阻后的膀胱平滑肌细胞在生长扩增中明显较正常膀胱平滑肌细胞时间长，也说明了这种酶消化法对膀胱平滑肌细胞的影响不是太大，还是保留着体内的基本特性。在我们的激光扫描共聚焦显微镜的检测中平滑肌细胞内的钙离子荧光强度在M受体激动剂的影响下发生明显变化，这更进一步证实了该方法分离培养出的膀胱平滑肌仍保持着收缩功能。

从实验研究中我们体会到该方法：1、简便、易行、易掌握及短期内可获大量高质单个膀胱平滑肌细胞；2、应严格无菌操作；3、仔细彻底剥除膀胱黏膜、黏膜下及浆膜层，是确保获的大量高质单个膀胱平滑肌细胞的基础；4、膀胱平滑肌组织应尽量减碎以确保充分消化；5、严格控制胶原酶和胰蛋白酶的浓度和消化时间，见消化液混浊、组织块呈絮状，或在倒置显微镜下见消化液中有较多单个细胞或细胞小团块时即终止消化；6、细胞筛的运用也是获得高质单个膀胱平滑肌细胞的基础。

1. Chamley CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture.Physiol Rev 1979 59（1）:1-61.

2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI.Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder .1996 Exp Physiol 81 (4):553-564.

3．Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and

their interaction with biopolymers.J Pediatr Surg. 2003 Jan;38(1):21-24.

4.Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human　detrusor smooth muscle. BJU Int. 2003 Sep;92(4):476-478.

5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties　of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells.J Urol. 2001 Feb;165(2):627-632.

SD大鼠VSMC的原代培养(贴块法)

实验材料：手术剪1把、手术钳2把、眼科剪刀2把 、眼科镊子1把 、大头针4个、手术刀片、无菌1×PBS约500ml 20%FBS的DMEM、5ml小皿3个、 10ml大皿1个、杀鼠板1块。（以上均为无菌物品）

实验步骤

1、 150-200gSD-大鼠，短头，浸入75%的酒精中15min

2、 置入超净台中，将大鼠固定于杀鼠板上，在无菌条件下打开腹腔，分离出胸主、腹主，摘出。

3、 PBS清洗3遍，剥去外膜，用手术刀片刮去内膜，留下中膜并将其移入1ml的培基中、剪成1×1mm大小组织块。

4、再将PBS清洗组织块，移入25ml 的培养瓶中，用尖嘴弯管均匀贴好组织块，放入37度5％CO2的培养箱倒置培养6小时后，待组织块贴壁后，再加入2.5ml培养液后放回37度5％CO2 的培养箱中。注意：最后加入2ml培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下，勿使组织块吹下。

5、 随后每3天予以全量换液。

6、 3-5天后可见组织块周围有细胞爬出，大约2周后80％融合。

本人曾做过3个月的SD大鼠VSMC的原代培养，基本上的所有的障碍都遇到过，现在已做的相当成功，并乐意与大家分享经验！

脾脏单个核细胞悬液的制备

(1) 大鼠断颈处死后，无菌取脾置于消毒平皿中称重

(2) 超净工作台上置10cm直径无菌平皿，加入5～10ml D-hanks平衡液 ，置一80目的不锈钢筛于平皿中，脾脏置于筛网中，用剪刀剪碎脾，用5ml玻璃注射器针芯轻轻捻磨脾脏，使分散的细胞滤过金属网进入平皿的液体中， D-hanks冲洗一次；

(3) 用吸管吸取冲洗液，200目的钢筛过滤一次后收集至离心管中；

(4) 1000rpm，离心5～10min，弃上清；

(5) 加入约1ml双蒸水，吸管打匀后20s后加入等量的1.8%的NaCl溶液，然后加入大量D-hanks调节渗透平衡，以***红细胞，但对白细胞没有影响；

用D-hanks液洗涤细胞2～3次，用含有1mM/L的谷氨酸胺、100IU/ml青霉素G、100μg/ml链霉素、 10%的胎牛血清的RPMI－1640重悬细胞，调节细胞浓度为5×106/ml，台盼兰染色检测细胞存活率大于95％；

(7) 接种至培养板或培养瓶中。

猪肺泡巨噬细胞的培养

1、细胞培养所用溶液及其配制

1×RPMI1640及：按照产品说明配制，过滤除菌，4℃保存备用。

新生牛血清：56℃灭活 30min，-20℃保存备用。

2×104U/ml青、链霉素液（双抗）：青链霉素各2×106 U溶于100ml灭菌双蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚红溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml双蒸水中，NaOH调节pH至7.2~7.5，过滤除菌，分装，-20℃ 保存备用，使用时1∶10倍稀释。

7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3溶于100ml双蒸水中，115℃高压灭菌15min，置4℃冰箱冷藏备用。

10% RPMI1640营养液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×104U/ml双抗，用0.5% NaHCO3或10% HCl溶液调节pH值至7.2~7.4。

2、将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用0.9%的生理盐水洗涤外表面，将pH7.2的PBS30.0ml从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌100目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，2000r/min离心10min，收集沉淀。洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的1×RPMI1640营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于37 度CO2培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。

神经细胞培养

一．设备： 无菌操作设备。

二．大型设备CO2培养箱：恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。

倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜，用于准确地取材。

常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。

电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。

过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。

渗透压仪，pH剂，天平等.

三．培养器皿及手术器械

1.培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。

2.培养板，24-40孔，可用于开放培养。

3.培养瓶；

4.吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5.各类培养液贮存器。

6.小型手术器械。

准备：

一.配制培养液

（1）解剖液：以无机盐（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS 缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。

（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。

（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。

（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。

二.培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶

三.消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

（一）选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

（二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。

（三）细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。

（四）抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。

大鼠心室肌微血管内皮细胞的原代培养

材料和方法

1. 仪器：

手术器械一套，倒置显微镜（Leica）,CO2细胞孵育箱（Heraeus），超净工作台（苏州净化设备有限公司），扫描电子显微镜（Hitachi）。

2. 主要试剂

DMEM 高糖培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105单克隆抗体（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗体（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗体（华美公司），抗兔及抗鼠ABC试剂盒、DAB显色试剂盒为华美公司产品，其他试剂均为国产分析纯以上级别。

3. 方法

3.1 植块法原代细胞培养[1]：

细胞培养瓶的处理[2]：选用50ml玻璃培养瓶，高压蒸汽灭菌，瓶底铺自制鼠尾胶（制作方法参见2），移入80℃烤箱烤干，临用前用消毒D-Hanks平衡盐缓冲液冲洗3次。

选用80克SD大鼠（雌雄不限，购自复旦大学实验动物部），1%戊巴比妥钠（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，将大鼠移至超净台进行操作，止血钳固定四肢，逐层打开胸腔，暴露心脏，剪开心包，由升主动脉处剪下心脏，放入D-Hanks平衡盐缓冲液中，冲净心腔中的血液，辨清心脏解剖结构，去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔，保留左心室，小心去除心内膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌约2mm见方，滴加1ml进口胎牛血清，均匀接种于处理过的50ml培养瓶中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞孵育箱静置培养，使其贴壁，4小时后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培养液4.5ml/瓶，约48小时后组织块周围有星形细胞长出，80至96小时组织块周围有大量细胞长出，去除组织块，继续培养36-48小时，待细胞汇合铺满瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化细胞进行传代，取用第二代细胞进行进一步鉴定和实验。

（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。

但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。

骨髓基质细胞的原代

材料方法

1. 材料：

1.1材料来源：取自健康成人行骨髓内固定术扩髓前收集骨髓腔内骨髓。

1.2主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、β-甘油磷酸钠（β-GP）、维生素C、青链霉素 、胰蛋白酶（1:250）-EDTA

1.3主要仪器设备 双人超净台 Farma Scientific美国 、单人超净台 Farma Scientific美国、二氧化碳孵箱、Farma Scientific美国、低温冰箱 Farma Scientific美国、倒置相差显微镜 Nikon 日本、细胞培养皿35Ф Corning 美国、6孔、96孔培养板 Corning 美国

2. 方法

2.1原代细胞培养：于髓内钉内固定术扩髓前，用肝素化后的注射器抽取3-5ml骨髓，置入预装有DMEM培养液的无菌 50ml离心管带至实验室。1000rpm离心10分钟弃上层脂肪，取沉淀细胞加入适量DMEM， 22G针头吹打成单细胞悬液，细胞计数后按所需浓度接种于培养瓶或培养板，加入完全培养液（含青链霉素各100u/ml,体积分数10%的胎牛血清、β- GP 10mmol/L、维生素C 50ng/ml、高糖DMEM）置于37℃,含体积分数5%的CO2 湿化空气孵箱中培养，3天后半量换液，以后隔日全量换液，倒置相差显微镜每日观察细胞生化情况。

2.2传代培养：原代培养至7-8天，细胞接近80%融合倒出培养液，1×PBS清洗两遍，用0.25%胰蛋白酶加 0.02%EDTA消化细胞2分钟，镜下观察至细胞分离脱壁后，立即加入完全培养液终止消化，细胞刮刀刮除细胞，将瓶内液体吸入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入完全培养液将细胞重悬，并混合均匀计数后接种于培养皿，行传代培养。

胚胎小鼠纹状体神经干细胞的分离培养及鉴定

①原代细胞的培养：取孕13.5天昆明种二级孕小鼠，引臼脱颈处死,碘酒、乙醇消毒腹部,逐层剖开腹部皮肤、肌肉、腹膜，取出子宫,放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔细剥离胎膜、羊膜，暴露胎鼠，剪开颅骨，取出胎鼠脑组织并转移至另一盛有D1-SGH液的器皿中，体视显微镜下剥离脑膜,分离胎鼠纹状体，仔细剥离血管及脑膜，将收集到的纹状体在D-hanks液中漂洗两次，置于盛有 4℃D-hanks液的器皿中，用虹膜剪将组织剪碎,加入0.125℅的胰酶消化(37℃，15min)，期间每隔5min震荡一次。500转离心 5min, 弃上清，D-hanks液清洗两次，将沉淀细胞重悬于增殖培养基中，培养基成分：DMEM/F12（1：1），2% B27 supplement，青霉素、链霉素各100U/ml，EGF 20 ng/mL，b-FGF 10ng/mL。用火焰抛光的吸管反复吹打，分散组织制成单细胞悬液，吸取9滴细胞悬液、1滴0.4℅台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板在3分钟内计数出活细胞和死细胞（台盼蓝排斥法），调整细胞密度，以105个/ mL接种75mL培养瓶中（NUNC）, 于5℅CO2 培养箱, 37℃培养。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。

②传代培养：当神经球直径大约100um时收集细胞于离心管中，600转离心5分钟，弃上清，加入无血清培养基重悬细胞，吸管轻轻吹打细胞，使之形成单细胞悬液，计数后以104个/ mL接种75mL培养瓶中，于5℅CO2 培养箱, 37℃培养，完成一次传代。此后每隔两天半量换液，5-7天机械分离细胞传代1次。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。

兔晶状体上皮细胞培养方法和体会：

1、原代培养：健康成年白家兔空气栓塞处死,立即取出眼球,1∶1000庆大霉素生理盐水冲洗干净,置超净工作台无菌操作。角膜缘剪开去除角膜、虹膜,将晶状体前囊膜连同赤道部囊膜撕下,Hank液冲洗,剪成1mm×1mm小块,上皮面向下置25mL组织培养瓶内贴壁培养。把培养瓶轻轻翻转,加入适量的加入含15%胎牛血清的DNEM营养液,囊膜片在瓶内的上面而培养液在下面。置于37℃、5%CO2、95%空气、100%湿度的CO2培养箱中孵育4-6h左右,待囊膜片贴壁后再将培养瓶调回原位,此时培养液覆盖囊膜片而不使囊膜片漂浮,每周换液2次。晶体上皮细胞在接种3天后,在倒置显微镜下可见,植块边缘有新生的细胞爬出,细胞呈规则六边形,大小均匀,胞质透明。一周后可融合成小片细胞。二周后可长满融合成单层细胞。细胞多为类圆形、多角形。

2、传代培养：细胞铺满瓶底或生长到一定密度时,用0.25%胰蛋白酶消化,1∶2传代培养。传代时在培养瓶或培养皿底放置适当大小的盖玻片,细胞生长其上,便于光镜及免疫组化观察。细胞一般24h内贴壁,约3～4d细胞可达融合,融合的细胞和原代相似,大小基本一致。传代超过4～6代时,细胞的增长显著下降,转变成成纤维细胞形、三角形和长形。

3、个人体会：晶状体上皮细胞位于晶状体前囊膜及赤道部囊膜下，单层排列，没有其他细胞成分，是绝对的单一细胞培养。但细胞数量少较难贴壁。所以采用先置于培养瓶待其贴壁后翻转浸入培养液。另外要注意将囊膜剪小，上皮面向下，操作时有点难度的。培养基没什么特别的，用小牛血清也可以，但生长较慢。一般把多个囊膜置于同一培养瓶加大组织密度，效果较好。

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