传代培养

传代培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

1 传代方法

　　传代培养

　　1．悬浮生长细胞传代

　　离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。

　　2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）

　　此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

　　3．贴壁生长细胞传代

　　采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

2 培养材料

　　1、无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS, GibcoBRL21600-010)

　　2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。

　　3、新鲜培养基

　　4、无菌吸管/离心管/培养瓶

3 培养步骤

　　1、附着型胞(adherentcell)

　　（1）吸掉旧培养液。

　　（2）用D-PBS洗涤细胞一至二次。

　　（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。

　　（4）轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

　　2、悬浮型细胞(suspensioncell)

　　（1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

　　（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

　　3、融合瘤(hybridoma)

　　（1）有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。

4 主要区别

　　原代培养：即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。有几方面含义：

　　1、培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；

　　2、原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；

　　3、原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。

　　正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。

　　原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。

　　多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer

　　culture），又叫贴壁培养（adherent

　　culture）。少数情况下，培养的细胞没有贴壁依赖性，可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在体外生长，这种形式称为悬浮培养（suspension

　　culture）。如何让接种的细胞尽快贴壁，是决定培养成功的关键步骤：

　　1、取决于适当的生长基质表面；

　　2、可降低接种后培养液对细胞的浮力，如先少补加少量培养液，待细胞贴壁后再补足营养液继续培养；

　　3、注意适当的细胞接种密度，一般105个/ml左右。

　　传代培养:当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

　　体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分割后再一次培养，可以相对地衡量培养物的培养年龄。

5 培养实验

　　实验原理

　　传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。

　　实验材料和器材

　　材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。

　　药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks液。

　　仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。实验步骤

　　1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。

　　2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

　　3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。

　　4．打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

　　5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

　　6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

　　7．倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2—3mLHanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

　　8．每个大培养瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

　　9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7～10mL／大瓶，3～5mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

　　10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

　　注意事项

　　1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

　　2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

　　3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等

6 培养细胞

　　在口腔医学领域，尽管人们已经能够重新构建牙冠结构，然而重新构建结构复杂的牙根始终是不少科研人员的终极梦想。第四军医大学口腔医院文玲英教授等在一项国家自然科学基金资助课题中，培养出了纯化的牙囊细胞，尽管这离重新构建牙根还有很长的距离，但毕竟又向前迈了一步。牙囊是牙胚的重要组成部分，随着牙齿的发育，由它分化的细胞形成牙骨质、牙周膜和部分牙槽骨，换句话说，由牙囊发育的组织结构主要负责将牙齿固定在牙槽骨上。另外在牙齿萌出的过程中，牙囊细胞还可能通过对一些细胞和因子进行调控，促进牙齿的顺利萌出。

　　牙囊细胞的重要功能吸引了研究者的目光，但要进行深入的研究就需要首先分离出纯化的牙囊细胞。早在上世纪90年代，国外就已经开展了分离牙囊的研究，但由于牙囊与成釉器（上皮来源）“关系密切”，始终难以简便地获得纯化的牙囊细胞。

　　据研究人员刘晓辉介绍，牙囊细胞和成釉器分别来源于外胚间充质和口腔上皮，这两类细胞在培养时对培养皿具有不同的黏附能力，当使用胰酶消化时，黏附能力较差的牙囊细胞会首先掉下来，成釉器上皮细胞则要慢一些，这就是差速消化的概念。利用差速消化法，收集牙囊细胞并进行传代培养，就称为差速传代技术。经3～4次差速传代，最终就可以得到纯化的牙囊细胞了。

　　在研究过程中，他们选用大鼠第一和第二磨牙牙胚，剥离出牙囊和成釉器作混合培养，经3次差速传代后，成功地从第4代牙胚原代细胞中获得了纯化的牙囊细胞。经细胞形态学及免疫化学染色检测结果显示纯化率达100％，细胞生长状态良好，增殖旺盛。

　　文教授说，差速传代培养技术是一种很有效且操作简单、廉价的研究方法，培养的高纯化牙囊细胞为今后牙齿组织工程提供了种子细胞，下一步他们准备将纯化牙囊细胞应用于牙根的重新构建研究中。