胚胎冷冻仪http://www.bitebo.com/a/gb2312/yiqi/CryoLogic/2010/0428/3073.html

程序降温仪http://www.bitebo.com/a/gb2312/yiqi/CryoLogic/2013/0904/5082.html

胚胎冷冻程序及方法

要点

•胚胎冷冻效果依赖于体外受精的成功率。如果新鲜胚胎的体外受精的效果不好，冷冻效果也会不好。

•成功的胚胎冷冻需要稳定精确的冷冻仪器，形态良好的胚胎及配子，以及精细的实验室操作。

仪器及耗材清单

1 程序冷冻仪

2 液氮储存罐:用于保存人的胚胎或细胞。

3 麦管或塑料冷冻管:无毒、无菌、质量优良。

4 冷冻及解冻液:FREEZE-KIT1/THAW-KIT1

(含有丙二醇)。FREEZE-KIT2/THAW-KIT2(含甘油与蔗糖)。

5 液氮使用量的多少由冷冻仪的类型以及储存罐的大小决定。

应在对细胞造成最小损害的情况下对其进行冷冻与解冻。细胞冷冻就是使用冷冻保护剂将细胞脱水以防止或减少在冷冻过程中发生细胞损伤。选择适宜的温度梯度将会有利于细胞的冷冻，同时还会使细胞最大程度脱水。在冷冻过程使用冷冻保护剂，将会降低细胞由于冷冻液的高渗透压及较高浓度而造成的危害。

不同的胚胎发育阶段需要不同的冷冻保护剂。1,2-丙二醇是原核卵与早期胚胎冷冻最常用的冷冻液，而囊胚期胚胎则常用甘油。冷冻及解冻过程的顺利与否是细胞能否存活的关键，而在液氮里储存胚胎则不会对其产生有害作用。

首先将胚胎放人冷冻保护剂中然后再放进麦管。接着用生理冷冻仪精确地降低麦管的温度。在冷冻液接近冰点时用液氦冷冻过的镊子诱导麦管液体结晶。该过程又称为植冰或冰核形成。如果不进行植冰或者植冰不充分，那么胚胎将会由于脱水不完全以及发生自植冰而遭受一定的损害。胚胎外植冰是胚胎脱水是否完全的关键点。

随着胚胎外无渗透能力溶剂浓度的增加以及胚胎外水分的结晶，胚胎内水分将会不断脱出脱水过程一直持续到胚胎达到冰点。如果冷冻过程太快胚胎脱水将会不完全。

如果胚胎解冻太慢，在缓慢升温过程中超冷水将会在细胞内发生结晶从而损害胚胎。胚胎解冻的速度一般由冷冻剂的类型及-40℃以下的冷冻速率所决定。如果胚胎冷冻过程较快(例如缓慢冷冻到-40℃)，那么解冻速率也要快(直接放人30℃温水中，500℃/分)。如果冷冻过程较慢(例如缓慢冷冻到-80℃)，那么解冻速率必须为10℃/分。丙二醇及甘油都需要快速解冻。

FREEZE-KITTM/THAW-KIT1TM

该方法可用于从原核阶段的卵子到8细胞胚胎的冷冻TM，该方法由TESTART

1986年的冷冻方法改进而来，使用丙二醇作为渗透性冷冻保护剂。蔗糖为非渗透性冷冻保护剂。蔗糖是一种能够促使细胞脱水的生物大分子，而且还能够在胚胎解冻时防止细胞溶解。因为各个步骤都是在培养箱外室温下进行的，因而须用磷酸盐缓冲液稳定PH波动。

FREEZE-KIT1TM成分：

Cryo-PBS: PBS+25mg/ml HSA

溶液1(FS1):1.5M丙二醇+ Cryo-PBS

溶液2(FS2):1.5M丙二醇+0.1M蔗糖+ Cryo-PBS

冷冻程序举例

起始温度 18℃

第一步 -2.0 ℃到–7.0℃

第二步 -7.0℃停留10分钟，2分钟后植冰(seeding)

第三步 -0.3℃到-30.0℃

第四步 -30.0℃到 -80.0℃ -1℃(至少10.0℃/分)

将麦管拿出并放进液氮罐中(为于液面以下，不要位于汽相)储存。

要点

• 因为胚胎解冻质量与胚胎起始质量密切相关，因此冷冻保存的必须是高质量胚胎。

• 在冷冻操作开始之前要仔细检查患者身份并且准备冷冻记录。

冷冻操作步骤

1 准备适当体积的冷冻液Cryo-PBS、FS1及FS2，并室温平衡。

2 将胚胎放入Cryo-PBS，观察并记录详细的形态变化(2-5分钟)。

3 然后将胚胎缓缓放入FS1保持10分钟(不要超过20分钟)。胚胎将会发生皱缩，随即又会达到平衡。

4 将胚胎放入FS2，然后用1ml注射针接到麦管上并将胚胎放入麦管。拿出麦管封口以防液氮漏入。

5 将麦管放进冷冻仪，开始冷冻程序。

6

-7.0℃时用液氮浸透过的棉签在接近麦管上部的部位进行植冰。一定不要在接近胚胎的部位植冰。不要将麦管拿出或者摇动。如果植冰部位有气泡胚胎的存活率将会下降。继续冷冻程序。

7 整个冷冻程序大约需要2小时，必须注意麦管低温时极易发生解冻。将麦管放入液氮罐，-196℃保存。

THAW-KIT1TM成份：

溶液1(TS1):1.0M丙二醇+ 0.2M蔗糖+Cryo-PBS

溶液2(TS2):0.5M丙二醇+0.2M蔗糖+ Cryo-PBS

溶液3(TS3):0.2M蔗糖+ Cryo-PBS

要点

• 解冻麦管时必须一次成功。

• 解冻操作在室温下进行(18-20℃)

• 确认患者身份并进行记录。

解冻操作步骤

1

确认患者身份找出相应麦管，并进行记录。将解冻液器皿上标上记号TS1，TS2，TS3及Cryo-PBS。

2 拿出麦管室温下解冻30秒。室温解冻时必须仔细检查麦管内是否有气泡、裂痕或者液氮渗漏。

3

将麦管放进30℃水中浴30秒。拿出小心擦干。消毒剪去一端，接上1ml注射器。然后剪去另一端，注意不要晃动以免造成气泡。

4

小心地将胚胎吹入TS1中。观察胚胎是否从麦管中被吹了出来，如果没被完全吹出来，应当吸取一点液体再次。胚胎可能会偶尔黏附在麦管壁上。

5 在TS1中孵育5分钟。

6 小心地将胚胎移入TS2保持5分钟。

7 移入TS3中5-10分钟。渗透压变化使质膜变脆弱。

8

将胚胎放进室温Cryo-PBS，接着放入37℃器皿中保持10分钟。不要放入二氧化碳培养箱，因为Cryo-PBS对5%CO2的缓冲能力不足。

9

然后可以将胚胎放入IVFTM、G1.2TM或者G2.2TM中。检测胚胎存活率并评价胚胎形态。这时的胚胎可以立即进行移植，也可以在培养一段时间后移植。原核卵子应当在IVFTM或者G1.2TM中培养过夜，如果分裂正常才能进行移植。

10

解冻操作过程对胚胎冷冻成功与否也极为关键。确保在适宜的时间将胚胎移植进入受体子宫。冷冻胚胎既可以在自然周期，在可以在人工周期移植。

FREEZE-KIT2TM/THAW-KIT2TM

FREEZE-KIT2TM/THAW-KIT2TM-冷冻/解冻法该方法由HARSHORNE等人的方法改编而来，用于囊胚的冷冻。

FREEZE-KIT2TM成份：

Incubation

1%的甘油

2%的甘油

4%的甘油

6%的甘油

8%的甘油

冷冻程序举例

第一步 从室内环境温度至-7℃，温度下降速率为1℃/分。

第二步 在-7℃停留5分钟并植冰(seeding)。

第三步 从-7℃慢慢降温至-30℃，温度下降率为0.3℃/分。

第四步 从-30℃迅速降温至约-150℃。

第五步 将麦管立即投入液氮罐(-196℃)

要点

• 因为胚胎解冻质量与胚胎起始质量密切相关，因此冷冻保存的必须是高质量胚胎。

• 在冷冻操作开始之前要仔细检查患者身份并且准备冷冻记录。

冷冻操作步骤：

1 检查并启动冷冻仪CL8800。

2

准备六个FALCON或者几个四孔皿，依次标记Incubation、1%、2%、4%、6%、及8%。

3 在各孔中依次加入适量的冷冻液。

4 将培养皿在37℃及5%CO2条件下平衡1小时。步骤5-10的培养条件与此相同。

5 将胚胎移入Incubation中孵育5分。

6 将胚胎移入1%的甘油不孵育10分。

7 将胚胎移入2%的甘油不孵育10分。

8 将胚胎移入4%的甘油不孵育10分。

9 将胚胎移入6%的甘油不孵育10分。

10 将胚胎移入8%的甘油不孵育10分。

11

用1mL注射针管将悬浮于8%冰冻液中的胚胎吸入麦管。冷冻液会浸入石棉塞，并会使其膨胀以堵住麦管。另一端封口，可用镊子烧热将麦管另一端热融封口。

12 拿出麦管热封，贴上标签装入冷冻仪。

13 立即启动冷冻程序。

14 在-7℃，用液氮冷冻的镊子植冰或用棉签在程序降温仪液氮浴桶内蘸少许液氮进行植冰。

15 继续执行冷冻程序，最后快速拿出麦管移入液氮。

16 然后将麦管放入储存罐。

THAW-KIT 2TM 成份：

8%的甘油

6%的甘油

5%的甘油

4%的甘油

3%的甘油

2%的甘油

1%的甘油

Incubation

要点

一次解冻一支麦管

确认患者身份并进行记录

解冻操作步骤：

1准备九个FALCON培养皿或者几个四孔皿，依次标记8%、6%、5%、4%、3%、2%、1%和两个Incubation皿。

2吸取适当体积的解冻液。另外准备一个G2.2TM或CCMTM培养皿。

3在37℃与5%CO2条件下平衡1小时。

4用37℃温水装满一个大烧杯。

5将麦管迅速从储存罐中取出，放进盛有液氮的容器，再次检查患者身份。

6从液氮中拿出麦管，用纱布迅速擦干并开始记时。用带有标记的镊子持住麦管在空气中解冻30秒。观察麦管是否漏液。

7将麦管轻轻放进30℃温水中孵育40-50秒。

8拿出麦管，用纱布擦干，然后用剪断麦管热封一端，接上注射针管。剪断石棉封口端，将囊胚推注到8%冰冻液中。如果没有胚胎，应再次冲冼麦管。将胚胎在8%甘油中放置5分钟。

9将胚胎转移到6%甘油中，并在37℃5%CO2条件下孵育10分。步骤10-14的培养条件与此相同。

10将胚胎转移到5%甘油中孵育12分。

11将胚胎转移到4%甘油中孵育12分。

12将胚胎转移到3%甘油中孵育12分。

13将胚胎转移到2%甘油中孵育12分。

14将胚胎转移到1%甘油中孵育12分。

15用Incubation冲冼胚胎两次。

16将胚胎移入G2.2TM或CCMTM培养皿中，在37℃5%CO2条件下孵育一时间。

17在显微镜下评估胚胎质量，并与未冷冻时的胚胎形态进行对比。

18培养胚胎直至移植日为止。

解冻步骤：①从液氮罐中取出麦管，室温中 40 秒(温度上升 300 ℃ /min ) ,用纸擦去麦管外面的冰;②麦管放入 30 ℃水中一分钟，见溶液中冰已融化;③取下塑料棒，剪去塑料塞，使F3 中胚胎流入 T1 放置 5 分钟;④转移胚胎到 T25 分钟， T35 分钟， T45分钟。这样令冷冻保护剂 PROH 及 Sucrose 逐步脱掉;⑤在培养液中洗 2

次后，将放入培养液中，置培养箱中继续培养 2 小时以后移植。

Seeding 常徒手操作，采用在液氮中浸泡过的镊子头迅速夹麦管中装有胚胎的 F3

液段，诱发结冰。在 -7 ℃须停留 7-10 分钟使全部液体结冰。

CL-8800型程序冷冻仪是当温度降到-7℃时用液氮冷冻的镊子植冰或用棉签在程序降温仪液氮浴桶内蘸少许液氮进行植冰。

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