配子与胚胎冷冻保存技术

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冷冻保存（cryopreservation）是以低温冷冻来维持生命，或更准确地说是使生命活动暂时停止而得以延长的一种低温生物学。其理论基础是当细胞内外的温度低得足以使其分子运动停止时，细胞代谢的各种生物化学过程也会停止。成功的冷冻保存技术必须能够使冷冻状态的生命系统可以在温度回升至正常时其生命活动也得到恢复并且无生物化学或结构上的损伤。冷冻保存是IVF-ET的重要相关技术，如果不能成功地冷冻人类精子、卵子及胚胎，辅助生殖技术就不能得以完善和发展，其效益也就不能得以充分利用。本文将对人类精子、卵子及胚胎的冷冻保存在辅助生殖技术中的应用加以介绍。

一、精子冷冻（sperm cryopreservation）

精子冷冻的成功始于Polge等在1949年意外发现甘油可以成为冷冻保存牛精子的有效冷冻保护剂。随后，许多哺乳动物精子的冷冻也以甘油为冷冻保护剂相继成功，包括人精子冷冻在1953年的成功。人精子冷冻保存技术的建立使辅助生殖技术的应用更为广泛而且有重要临床意义。

1、精子冷冻的临床意义

精子冷冻为男性提供了短期和长期保存生殖力的选择。通常在如下情况时人们需要冷冻保存精子：

1) 输精管切除术: 多数男性选择做输精管切除术作为永久性避孕的一种手段。当未预料的情况发生时，比如新婚、丧子或想要更多孩子等，男性需要恢复其输精管功能时，虽然输精管切除术可以手术修复，但是手术费用昂贵、侵入性强、成效不稳定。而且，既使初步修复成功，术后疤痕组织也可能会造成输精管堵塞。因此，许多人会选择在做输精管切除术之前冷冻保存部分精子以备后用。

2) 恶性肿瘤病的治疗：类似于白血病、睾丸癌和其它恶性肿瘤常常在尚未开始或完成生育的年轻人群发病，幸运的是，随著诊断及治疗手段的提高，患者的存活率提高了很多。但是化学疗法或放射疗法都会严重影响精子的生成，有时甚至可能导致永久不育。既使从诊断出恶性肿瘤到开始治疗的时间再短，患者都还有时间安排冷冻精子以备后用。

3) 人工授精之前：当男性不育是由于精子数量轻度不够时，可以考虑采用一或多次冷冻精子富集法而后再与新鲜的精子混合起来进行人工授精。

4) 不能在人工授精或体外受精当天提供新鲜精子时：当丈夫不能保证陪同妻子进行人工授精或体外受精时，或由于各种原因使得丈夫既使可以陪同但也可能无法保证及时采集和提供新鲜精子时，只能预先冷冻保存足够的精子以备后需。特别是在患者接受体外受精治疗时，高度建议患者预先冷冻保存足够的精子作为备用以保障体外受精的治疗不会被意外情况下没有新鲜精子时延误。

5) 需要将精样在特定实验室做遗传检测：将冷冻的精样运输到特定实验室做遗传检测，这样就可以避免远离实验室的精供体做不必要的旅行。

6) 精子供体：精子冷冻保存技术为供体捐献精子提供了方便，是精子库建立的前提和基础。

2、精子冷冻的方法

目前临床上最常用的精子冷冻液是添加了7-8%甘油的TYB冷冻保存液（TEST-yolk buffer， TYB， Irvine Scientific，）。冷冻精子的具体操作如下：

1) 采集的精样液化后，可以直接或经过清洗处理后，在按体积比 1:1缓慢加入精子冷冻液，用冷冻细管或小瓶冷冻分装并标记姓名、时间、代号等，随之迅速降温至0-4oC

2) 可以用冷冻仪控制降温，将分装好的细管或小瓶装入冷冻仪，从0oC起以每分钟1oC的速率降温至-30oC，再以每分钟5oC的速率降温至-80oC后迅速将细管或小瓶投入液氮保存

3) 可以不用冷冻仪而用液氮蒸气，将分装好的细管或小瓶固定在距离液氮表面 9 厘米停留约15分钟，然后降至距液氮表面1.5厘米停留约两小时，随后迅速将细管或小瓶投入液氮保存

4) 保持样品浸泡在液氮中直到取出解冻使用

人精子冷冻技术在辅助生殖领域已经成为一个常规技术被广泛使用，有着稳定的冷冻解冻效果。除了精子活动力一般会减少30-50%外，尚没有数据表面冷冻解冻对精子或从之获得的胚胎有直接相关的伤害。

二、卵子冷冻（oocyte cryopreservation）

与精子细胞相比，卵子细胞的体积大、细胞含水多、成熟卵子染色体排列有规律、纺锤体极易被细胞内冰晶的形成而破坏，因而冷冻卵子相对困难得多。自人类首例从冷冻解冻卵子获得的体外受精后代于1986年降生以来，卵子冷冻技术被广泛关注。在卵子冷冻最初应用的几年里，大多数学者是将人胚胎冷冻的方法直接或稍加修改地应用到卵子冷冻上，虽然获得了一些成功，但总体效率非常低，因而尚未成为临床上可以常规应用的技术。虽然所得到的后代中还未见到有与卵子冷冻直接或间接相关的异常，但对于是否冷冻解冻过程本身会破坏成熟卵子减数分裂的纺锤体而导致染色体数目畸形的胚胎，仍是人们广泛关注的问题。近几年来卵子冷冻有了进一步的发展和更多的临床应用，人们正拭目以待更多的数据证明其成功的稳定性和安全性。笔者相信在不久的几年之内卵子冷冻会有突破性进展而最终成为辅助生殖中的一项重要而极有意义的常规技术。

1、卵子冷冻的意义

卵子冷冻有极为重要的意义和临床价值。这主要表现在以下几个方面：

1) 建立卵子库从而为卵巢功能丧失的妇女提供价格不太昂贵的供体卵

2) 对需要延迟生育的妇女提供冷冻保存自身卵子的选择

3) 为面临化学或放射治疗的恶性肿瘤患者提供保存自身卵子的机会

4) 为IVF-ET病人，尤其是对于有强烈信仰而拒绝冷冻或丢弃多余胚胎的患者，提供了冷冻保存多余卵子的选择

5) 在 IVF-ET治疗中产生临床意外的情况下，包括卵子采集后没能及时得到可用精子，或病人在取卵手术后由于各种原因不能继续IVF-ET治疗时，冷冻卵子技术为病人提供了保存卵子以备后用的机会

6) 为接受捐增卵子的夫妇提供了卵子采集后隔离留验卵子供体传染病（retrospective donor screening）的选择

2、卵子冷冻的应用

目前报道使用较多的卵子冷冻方法主要有两种：慢速冷冻法（slow freezing）和玻璃样化冷冻法（vitrification），这两种方法都已经成功地在胚胎冷冻上成功应用，对于卵子冷冻，这两种方法都有待更多临床数据说明其成功率、稳定性及安全性，尚无一种方法被广泛认可。卵子冷冻技术在生殖领域中的应用还属研究阶段，商家对于其商业化的卵子冷冻液正在积极收集临床数据，尚未面向辅助生殖医学领域公开合理销售。

三、胚胎冷冻（embryo cryopreservation）

冷冻保存细胞的理论基础在1965年就被Mazur提出。经过几年的探索，终于在1972年获得了小鼠冷冻胚胎移植的成功。随后，冷冻胚胎移植相继在22种哺乳动物上获得成功。继人类第一例冷冻解冻胚胎移植在1983年获得成功，人胚胎冷冻就成为IVF-ET中一项重要附属常规技术。根据美国疾控制中心的统计，在2001

年中，至少有5047位婴儿是移植经过冷冻-解冻的胚胎获得的。

1、胚胎冷冻的意义

随著超数排卵技术在IVF-ET上的应用，一次IVF-ET有时会得到10个以上，甚至20个成熟卵子，继而得到了多余得胚胎。如果没有胚胎冷冻技术，为安全起见，通常病人在无可奈何的情况下不得不只移植3-4个胚胎，而被迫将多余的胚胎浪费。因为移植过多的胚胎会引起多胎怀孕，可能最终会导致严重危险。

胚胎冷冻技术的成功建立避免了多余胚胎的浪费。病人不仅可以有一次新鲜胚胎移植，还可以利用冷冻保存的多余胚胎做一次或多次的冷冻胚胎移植，增加了一次IVF-ET的效率及病人怀孕的机会。目前，早期人胚胎可以成功地在不同发育阶段被冷冻，而囊胚期胚胎冷冻技术的建立为囊胚期胚胎移植提供了方便，因而对减少移植胚胎数目继而降低IVF-ET多胎妊娠起到了积极推动作用。同时，当IVF-ET治疗过程中出现意外情况始，例如，病人采卵手术后由于各种原因不宜继续IVF-ET治疗，冷冻保存技术使得病人有将胚胎保存以备后用的选择。而对于恶性肿瘤年轻患者，在开始化学治疗或放射性治疗之前通过IVF将所得胚胎冷冻保存，则为病人保留了今后生儿育女的希望。

2、胚胎冷冻的方法

目前，临床上常用的胚胎冷冻法主要包括两个：慢速冷冻法（slow freezing）和玻璃样化冷冻法（vitrification）。早期人胚胎在不同发育阶段，包括原核期胚胎（受精卵）、分裂期（二细胞至八细胞期）、桑椹胚期和囊胚期，都可以用这两种方法进行冷冻。其中，慢速冷冻法比玻璃样化冷冻法在辅助生殖医学中的应用更为广泛，是大多数IVF实验室的常规胚胎冷冻技术。

1) 慢速冷冻法：包括以PROH（propanediol，PROH）为冷冻保护剂和以甘油(glycerol)为冷冻保护剂的慢速冷冻法。这两种方法的冷冻、解冻溶液都含有20%的SSS（synthetic serum substitute）。

以PROH为冷冻保护剂的方法适用于原核期胚胎和分裂期胚胎的冷冻，胚胎要在含有1.5M PROH的溶液中在室温下停留10-15分钟，然后移入1.5M PROH、0.1M 蔗糖的溶液中，在室温下装入冷冻细管或小瓶中，然后用冷冻仪按以下程序自室温开始以每分钟2oC降温至-7oC，平衡10分钟后植冰，再以每分钟0.3oC的速度降温至-38oC，立即投入液氮保存。解冻时，将冷冻细管或小瓶从液氮中取出，在空气中停留半分钟。再将冷冻细管或小瓶放入30oC水浴中直至冰晶消失。将冷冻细管或小瓶的内容物放出，从中找出胚胎后将其移入含1.0M PROH、0.2M 蔗糖的溶液中平衡5分钟。再将胚胎移入含0.5M PROH、0.2M 蔗糖的溶液中平衡7分钟，之后将胚胎移入含0.2M蔗糖的溶液中平衡5分钟。在将胚胎移入含10% SSS 的培养液使温度从室温回升至37oC。解冻后的胚胎可放入培养箱培养目标2-4小时后进行胚胎移植。

以甘油作为冷冻保护剂的慢速法适用于囊胚期胚胎冷冻。冷冻囊胚時，先將胚胎移入含9% 甘油和20% SSS 的培养液在室温下平衡10 分钟，再將胚胎移入含9% 甘油，0.2M蔗糖和20% SSS 的培养液中并装入冷冻细管或小瓶中。然后用冷冻仪按以下程序自室温开始以每分钟2oC降温至-7oC，平衡10分钟后植冰，然后以每分钟0.3oC降温至-36oC，立即投入液氮保存。解冻时，将冷冻细管或小瓶从液氮中取出，在空气中停留半分钟。再将冷冻细管或小瓶放入30 oC水浴中直至冰晶消失。将冷冻细管或小瓶的内容物放出并从中找出胚胎后将其移入含0.5M 蔗糖的溶液中平衡10分钟。再将胚胎移入含0.2M 蔗糖的溶液中平衡5分钟。最后将胚胎移入含20% SSS 的培养液使温度从室温生至37oC。解冻后的胚胎可放入培养箱培养2-4小时后进行胚胎移植。

2) 玻璃样化冷冻法

含高浓度冷冻保护剂的溶液在冷冻时的固化不是通过结晶，而是通过粘度极度增加的特点，从液态变为无结构的玻璃状态，这种玻璃状态能保持其溶液状态的分子和离子分布，被认为是一种极其粘稠的超冻液体。由于玻璃化法不产生细胞内结晶，不需充分脱水，跨膜物质浓度与渗透压差不大，不易产生不可逆的细胞膜损伤而引起细胞死亡。在玻璃化冷冻液中加入大分子物质如聚烯吡酮(PVP)或人血清白蛋白有利于形成玻璃样化，但这些大分子物质包被在透明带上稳定了透明带上糖蛋白的结构，使其不易破裂，从而降低了在冷冻过程中渗透压变化对胚胎的副作用。

玻璃样化冷冻尚未成为常规冷冻方法,各实验室也没有统一的材料方法。相对来说, 胚胎冷冻微细管是一种比较容易操作的办法。在加热平台上将平时冷冻胚胎用的细管拉细至内经约0.8 mm, 管壁约0.07 mm, 并将其从最细处切开。在玻璃样化冷冻之前，将胚胎移入含有7.5 % 乙二醇(ethylene glycol)，7.5 % 二甲基亚砜(DMSO)和20% SSS 的PBS。三分钟后将胚胎移入含有16.5 % 乙二醇，16.5 % 二甲基亚砜，0.5蔗糖和10% SSS 的20 µl PBS (phosphate buffered solution) 小滴内。再将一到三枚胚胎连同1到2 µl PBS放到细胞培养盘表面。然后利用毛细作用将胚胎装入拉細的胚胎冷冻细管内。随后将细管立即投入液氮。

解冻时，将冷冻细管从液氮中取出，将内容物挤出并从中找出胚胎。让胚胎通过1.0 M，0.75 M，0.5 M，25.0 M，0.12 M 的蔗糖浓度梯度，每步2.5分钟。最后将胚胎移入含10% SSS 的培养液并从室温生至37oC。解冻后的胚胎可放入培养箱培养2-4小时直至胚胎移植。

3) 胚胎冷冻的局限性

用以上不同方法冷冻解冻胚胎时,平均存活率均为50%-70%, 而并非100%的存活. 因此,胚胎经过冷冻解冻的过程平均有大约50%-30%的损失. 而且,冷冻保护剂对胚胎是有毒性的,如果操作时间过长,胚胎的存活率就会下降. 另外，在冷冻解冻的过程中，胚胎也可能会在降温和生温的压力变化下破碎，甚至丢失；有时胚胎也会部分死亡，这时其存活力也会受损；如果需要长期保存冷冻胚胎，费用也可能会成为经济负担。在长期保存胚胎时，如果人为操纵稍不谨慎，既是是一两秒中将冷冻细管暴露在空气，都立即会影响胚胎的活力，因此，虽然在液氮浸泡中理论上胚胎可以存活许多年，但实际上由于保存过程中的人为因素，冷冻胚胎很容易被伤害但还不留痕迹。这些都是胚胎冷冻的局限性。

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