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微生物发酵床垫料微生物总DNA提取方法的研究

作者:admin 来源:本站 发布时间: 2014-09-20 17:55  浏览次数:
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刘云浩1,2,蓝江林2,刘波2*,朱昌雄1,陈燕萍2
(1.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所,北京 100081;2.福建省农业科学院农业生物资源研究所,福州 350003)

发酵床养猪垫料是以谷壳、锯末、猪粪便加益生菌够成的发酵物,类似土壤,但又有区别于土壤,由于没有专门对应猪垫料DNA提取的试剂盒以及相应比较成熟的提取方法。故本采用试剂盒和相关文献的方法作为参考,对垫料总DNA的提取进行摸索。
样品采集自中国人民解放军73121部队福建福州新店养猪场,垫料使用时间3-5个月。分别采用土壤总DNA提取试剂盒法、粪便总DNA提取试剂盒法、淤泥总DNA提取试剂盒法、SDS法、CTAB 法和SDS-CTAB结合法提取养猪发酵床垫料微生物总DNA,对6种方法提取的DNA的浓度和纯度进行比较评价。
采用土壤总DNA提取试剂盒法提取四种垫料的DNA,所得到的DNA浓度最低,质量也很低,并且纯度也很低,A260/A280为2.0左右甚至更高,A260/A230为 0.3左右;粪便试剂盒提取法提取的DNA浓度最高,但是DNA质量和纯度不够高,A260/A280为1.5左右,A260/A230为0.3左右;淤泥总DNA提取试剂盒法只有A1的微生物总DNA纯度比较好,但浓度较低,A260/A280为1.5左右,A260/A230为 0.5左右;SDS法和CTAB法得到的DNA虽然浓度都很高,但是纯度都太低;只有SDS-CTAB结合法所提取的纯度最高,而且浓度也较高,A260/A280为1.8左右,A260/A230在 1.4以上。由于土壤总DNA提取试剂盒法所提取的DNA质量和浓度都很低,16S rDNA通用引物PCR扩增之后没有目的条带出现;而粪便试剂盒法,SDS法以及CTAB法提取的DNA含有大量的腐殖酸,并呈现出黄褐色,严重影响后续的PCR,以至于扩增不出目的条带;虽然淤泥总DNA试剂盒法提取的DNA纯度要高于上面的几种方法,但是提取的DNA也还是会呈现出淡黄色,所以在后续PCR时也只有一种垫料的DNA扩增出了目的条带,这对于不同发酵程度的垫料来讲,没有针对性;而SDS-CTAB法所提取的四种发酵程度不同的垫料的DNA都具有很高的纯度,DNA溶液比较清澈透明,直接DNA电泳能得到比较单一的条带,后续的PCR也能扩增出比较亮的目的条带。
综合分析表明,试剂盒法因为没有专门针对本实验垫料的DNA提取试剂盒,所采用粪便,土壤以及淤泥试剂盒都没有达到很好的效果,而在化学法当中,单纯的SDS法和CTAB法都不能有效除去腐殖酸和杂蛋白的污染,只有SDS-CTAB结合法提取的DNA具有完整性好,纯度高,不需要纯化直接就可用于PCR扩增,有利于进行下游的分子生态学研究。

关键词:垫料微生物 DNA提取 SDS-CTAB 16SrDNA

 

                                                                                     

基金项目:国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX07425-002);国家科技支撑项目(2008BAD96B07);福建省发改委项目(闽发改投资[2008]762号);福建省属公益类科研院所基本科研专项(2010R1020-1)。
作者简介:刘云浩(1988-),男,硕士研究生。研究方向:应用微生物,E-mail:1988yh@gmail.com
* 通讯作者:刘波(1957-),男,博士,研究员,研究方向:微生物生物技术与农业生物药物。E-mail:liubofz@163.com.

 

 

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