土壤中抗生素抗性基因丰度不断增加

C.W. Knapp, J. Dolfing, P.A.I Ehlert, et al.

前言

在过去的几十年里，抗生素抗药性（AR）引起了越来越多的关注。抗甲氧西林金黄葡萄球菌（MRSA）、抗万古霉素肠球菌（VRE）等具有传染性的“超级细菌”的出现正在威胁着世界范围内的健康服务系统。有趣的是，环境微生物（即肠道系统之外的物种）对抗生素化合物的抗性是一个自然现象，特别是在土壤中更是如此；然而，至今还不清楚超级细菌的传染性与环境微生物的抗性是什么样的相互关系。例如，尽管二次大战以来抗生素和抑菌剂的工业生产显著增加，但还不清楚自然土壤中的AR背景值是否发生了变化。这可能是因为环境微生物同时暴露于抑菌剂、重金属以及其他不利环境之中，致病微生物可能会在土壤有机体中为抗性特征提供汇集的场所，这将对公众健康造成更为广泛的不利影响。虽然不能明确超级细菌与环境有机体之间的关系，但将现在土壤中与大范围抗生素工业生产之前土壤中AR的水平（作为研究的初始点）加以对比也是非常有意义，这也是本研究的基础。

青霉素是最早被广泛使用的一种抗生素（1928年Alexander Fleming发现），在20世纪40年代早期实现了大批量生产。随后很快链霉素、四环素和其他抗生素也进入了工业生产阶段。生产能力的不断提高以及价格的不断下降促进了抗生素在医疗领域之外的应用。例如，研究发现低剂量的抗生素能够促进牲畜的生长，因此常被作为预防药剂加入到动物饲料中。随着应用领域的不断扩大，抑菌剂的生产和使用不断增加。尽管还无法准确计算抗生素的年使用量及年生产量，但贸易数据显示，在1990年前抗生素的生产呈现指数增加的趋势，其中大于50%的抗生素被用于农业生产领域。

抗性生物的发现使得抑菌剂在人类药物及农业方面的使用更加审慎，但依然能在城市污水、地表水、海洋、沉积物及土壤中检测出抗生素抗性基因（ARG）。另外，有迹象表明环境中抗性微生物能够积蓄AR特性，它们可能会通过水平基

因传递或其他机制将对抗生物的抗性传递给病原体。因此评价抗生素和抑菌剂的使用是否已经改变并持续改变自然中的“背景”抗性水平，判断环境生物体是否有机会将抗性传递给病原体就显得非常重要了。

幸运的是，最近的研究发现，档案土壤提取出的DNA为了解历史微生物群落提供了非常有价值的信息。在这种理念的指导下，我们获取了荷兰乡村5个长期监测点位1940~2008年间的档案土壤样品，定量分析了土壤中18种抗性决定子（包括针对超广谱β-内酰胺酶、四环素、红微素和糖肽类抗生素的ARG）的丰度。尽管ARG并不一定实现抗性的表达，但它们能够反映抗性的“潜力”，这也是唯一可用的标记物，可以比较它们在历史样品中丰度的差异并研究长期的变化趋势。本研究采用的档案土壤在土壤类型、灌溉水和肥料使用历史、重金属暴露等方面具有差异，这也为研究ARG水平的影响因素提供了便利条件。最后测定了微生物16S-rRNA基因水平，用来比较采集时土壤中的微生物水平，评价土壤储存条件对DNA的影响，利用每个土壤中的微生物总量将ARG水平进行标准化，利于尽心对比分析。

材料与方法

采用的档案土壤土壤样品来源荷兰瓦格宁根大学和研究中心的TAGA土壤档案系统。TAGA系统包括1879年以来多项研究所用的土壤，本研究采用土壤基本情况见表1（表略），其地理位置见图1（图略）。需要特别强调的是土壤采集的目的并不是用于该研究，采样点位有用的背景信息较少，较为久远的土壤更少如此。因此，我们必须限定本研究的结论，只能得出一个总体趋势而非详细的特征信息。

例如，点位A位于Wieringerwerf，在1960年至1986年间的一项关于滨海粉质壤土再利用的农业研究中采集了土壤样品。该点位于1930年从Waddenzee收回，在1940年左右开始用于农业生产，1955年开始燕麦、小麦和马铃薯轮作，为了研究无机肥料对作物轮作的影响研究人员采集了土壤样品。该点位主要使用矿物肥料，包括氮磷钾肥，在该研究期间，燕麦种植时也间歇性地施用了有机肥，施用量约为135t/hm2，但是有机肥添加的具体时间没有详细记录。点位B位于荷兰东部的Heino，土壤为腐殖砂土（1950~1971年），施用了有机肥及无机肥料，试验期间的有机肥使用量约为1 250t/hm2。由于较大的有机肥使用量，因此我们将该点位假定为有较高ARG水平的“正参照”，但是研究结果并非如此。

点位C位于Wieringerwerf的Slootdorp村庄，土壤类型为滨海粉质壤土，为了评价钾肥的功效进行了田间试验，在1940~1975年间采集了表层土壤样品（0~25 cm）。试验期间钾肥的施用量约为80t/hm2，时间约为20世纪60年代，准确时间未记录。点位D的土壤主要是轻度滨海粘土，与Wieringerwerf的土壤（点位A和C）较为类似，灌溉水来自于艾塞尔湖的入口。点位E主要为砂土（76.8%的砂子，16~2 000μm），地下水位多变（冬季小于1m，夏季大于1.5m）。点位D和E主要研究磷矿粉作为磷肥的可行性，没有添加有机肥，都具有沟渠灌溉系统，但点位E的灌溉水来自VAM kanaal和Oude Diep，而非艾塞尔湖。

样品处理及DNA提取土壤在30~40℃下风干，研磨，档案室内室温下保存。土壤DNA提取采用UltraClean土壤DNA提取试剂盒，在厂家操作手册的基础上进行了一些修改。称量150~300mg的土壤（干重）放入事先准备好的装有缓冲液和提取剂的离心管中。缓冲液预冷至4℃，样品培养30min使其再水化。在Hybaid Ribolyzer中进行细胞溶解，样品在70℃下培养10min以帮助革兰氏阳性菌的溶解，在ribolyzer中再次震荡。根据厂家操作手册对样品进行进一步的纯化。DNA提取液在-20℃下短暂保存（若长期保持则要在-80℃下）。前期研究表明，DNA干燥和保存对原核和真核微生物的可检测部分没有明显的影响，本研究再次验证了这一点。

qPCR方法青霉素、四环素、大环内酯（如红微素）和万古霉素的使用历史已达80a之久，不同的抗生素使用年限也有差异。之所以选择这些抗生素和抑菌剂的抗性决定子并加以对比，是因为它们代表不同的药物类型、靶位以及作用方式，并在不同的年代曾应用于农业和医药领域。使用实时qPCR进行18种ARG和16S rRNA基因丰度的定量测定。尽管不可能对所有的可能基因加以定量化，但选择的基因代表了不同的药物种类，能够反映不同的抗性机理。为目标抗性基因选择或指定合适的引物和探针，这些信息总结在表2（表略）中。参照已发表的方法进行四环素抗性决定子[tet(B)、tet(L)、tet(M)、tet(O)、tet(Q)和tet(W)]的分析，红微素抗性甲基化酶决定子[erm(B)、erm(C)、erm(E)、erm(F)]，以及vanA、vanB、mecA、ampC、blaTEM-1、blaCTX-M、blaSHV-1和blaOXA-1的测定均参照已发表的方法。

探针和引物设计 16S rRNA基因分析使用了普适性真细菌探针和引物，它们也常用于qPCR反应中测定微生物总量。根据前期建立的方法筛选tet决定子、ampC（氮苄青霉素抗性，group-1, class-C ESBL）、vanA（万古霉素抗性基因）以及blaCTX-M（group 2，class D ESBL）适合的引物和探针，最终使用了TaqMan探针。第2个万古霉素抗性基因（vanB）参照Palladino等的方法，并加以修改。对NCBI GenBank网站上的BLASTn检索并以细微修改以增加分析的普适性；用VanB-FL探针序列替代原有的正义引物，将VanB-640结合到TaqMan探针之中，而反义引物（VanBR）则保持不变。甲氧西林抗体（mecA）分析包括Rieschl等发现的正义引物、TaqMan以及Tan等发现的反义引物。

本研究依然采用了文献中发表的正义和反义引物，但对Erm决定子进行了修改使其适应qPCR的需要，降低扩增子的长度（通常小于200bp）。然而，根据Primer3软件及联合GenBank序列的结果我们还设计了其他的引物。利用BLASTn软件测试引物的特异性，随后在不同的退火温度下通过试验检测所有引物的反应。

在文献发表的2种通用引物blaTEM-F和5’-GGAATAAGGGCGACA的基础上构造出了blaTEM，将之作为反义引物。在blaTEM-1和blaTEM-2序列及Primer3软件的基础上进行引物筛选。根据最近的BLASTn检索结果，对选择的blaTEM引物对的通用性加以测定，发现包括1~3、6、10、12、21、22、26、54、60、67、70-72、77~84、89、104~107、109、128~129、131、138、144、150~152、158、162和163等TEM-变量。blaSHV（blaSHV-F和blaSHV-R）的引物利用相类似的方法加以构建；对其通用性加以检测，它主要包括1~2、5、7、11~14、18、25~26、28、30~31、36~37、42、55~56、59~66、69~71、73~83、89、93~96和104。blaOXA-1的目标物为blaOXA的第1簇；正义引物是Moland发现的反义引物的反向互补序列以及未经改变过的反义引物。使用的GenBank序列包括AY008291、J02967、EF415651、EU117233和AF227505，其分析的标的物是blaOXA-4和blaOXA-30。

qPCR方法反应条件。DNA模板（2μL）、合适的引物、TaqMan探针与iQ supermix PCR试剂、分子级水混合起来，体积为25μL。在配有iQ荧光检测器、2.3版本软件的BioRad iCycler中开始反应。温度循环方式为95℃（10min）、94℃循环40~45次（20s），随后为退火及延伸条件（见表2，表略）。所有样品重复2次，任何样品出现较大的偏差（较高的分析差异）都将重新分析。平行样品的差异在±0.3（对数比例）以内。很多情况下，常检测TaqMan探针、双重标记的具有5’-荧光团和3’-淬火团的寡核苷酸。除此之外，SYBR-green I、非特异性荧光染料也可用于检测，随之绘制温度溶化曲线来确保反应质量（50~95℃，ΔT =0.1℃/s）。

所有反应都需要用梯度稀释的已知量的质粒-DNA标准品（用革兰氏阳性菌制作）加以检验。向样品中添加已知量的模板，对比该混合样品与对照样品在浓度临界值（CT）上的差异（通常小于1个循环的差异），判断样品中是否有某种抑制物质。用分子级水按照1:100（点位A和B）或1:1 000（点位C-E）将其稀释能够很好地减弱抑制物质的影响。另外，为了检测是否有抑制物质，可以对比某些样品（指的是那些具有较高DNA浓度的样品）梯度稀释溶液和质粒对照样品的PCR效率（通常处于75%~110%）。所有标准曲线的相关系数都高于0.990，对数基因丰度值也处于标准曲线的线性范围之内。

数据分析 ARG丰度需要对16S rRNA基因丰度进行标准化，以减弱不同提取过程和分析效率引起的分析偏差，缩小背景微生物丰度的差异。这就在每个采样点位生成了一系列时间序列的相对ARG值。利用这些数据结合不同的回归模型（如线性、指数或幂函数），可以评价出各种基因随着时间的变化趋势，残差和决定系数（R2）可以用于选择最佳模型。在时间序列中指数函数的拟合效果最好。

在长期趋势分析中（即从1940~2008年），采用了几种不同的方法来整合不同的时间序列，最后得出结论，当所有时间序列都有数据时，可以使用最小偏差法将所有“ARG与16S rRNA的比值”整合于某一个时间窗（即20世纪70年代中期）的试验数据，因此每一种ARG在1970~1979年的平均值就被赋予值1.0，而1970~1979年时间段之前和之后的单位ARG水平则通过比例变化加以计算。这个整合过程将不同时间段的监测结果统一起来，消除了每个采样点位在土壤类型或其他条件上的不同所导致的背景ARG和16S rRNA基因水平的差异。整合后的数值用于测定某种基因的长期变化趋势，以及某种抗生素类别下所有检测基因的总体趋势。后面一个步骤是非常有价值的，因为它能够将不同时间段的数据集中起来，增加不同趋势预测的统计学意义。

结果和讨论

选用了5个土壤系列进行测试，是因为它们从二战结束至今均经历了抗生素的大批量生产，在这段时期内，20世纪70年代末荷兰改进了对废物处理的程序，并且过去的10年非治疗性抗生素在农业领域的使用越来越受限制。图1和表1概述了这些土壤的位置和类型、水资源、有机肥的施用水平以及样品采集后所保存的时间，这些特征在不同的土壤系列中略有不同。本研究也考虑了其它点位档案土壤，它们可能能够代表更长的时间窗口，然而，我们最后选择仅关注TAGA的档案土壤，因为它们的处理和储存方法比较明确且均一。

在所有土壤样品中，每克土壤（干重）中的16S-rRNA基因含量处于108~1 010，上层土壤更是如此。为了测试土壤样品退化的可能性，对每个系列的土壤中16S-rRNA含量值的对数随时间的变化进行了线性回归分析。然而，在档案土壤样品中并未观察到每克干土中16S-rRNA含量水平随时间有显著的变化（r2<0.48，p>0.13）。因此，虽然其他研究指出档案土壤储存过程中可能伴随这土壤的污染或DNA降解，本研究并未发现这种现象。

计算了5个采样点位每种抗生素的单一基因及所有基因的ARG相对于16S-rRNA的相对丰度（标准化）（包括每个采样点位中每个土壤样品的绝对及相对基因丰度）。在ARG随时间变化的首次评价中，标准化的某种ARG随时间的变化用指数模型模拟，来测定每一点位基因的总体变化趋势。尽管只有31%的速率系数具有统计意义上的显著性（p<0.10），但有78%（64中的50个）的标准化单一ARG随着时间的推移逐渐增加。然而，有4个点位的标准化单一ARG水平，即点位C的所有系数为正，而点位A、E和D都具有3个以下的负系数。事实上，只有点位B的标准化相对ARG水平没有明显增加。此外，测定的主要类别的抗生素抗性基因的含量都随着时间的推移而逐渐增加，其中四环素抗性基因含量的增加更加频繁地表现出统计意义上的显著。

虽然这些结果提供了一些信息，并大致表明ARG水平随时间增加而增加，但是它们并没有描述出ARG含量的长期变化趋势，因为每一个土壤系列代表了不同的时间段。因此，这些标准化的数值被整合为1970~1979年测定数值的平均值，5个点位的时间序列都包括这个时间段。这一方法为1940~2008年每种ARG及ARG种类提供了一个综合的时间序列，虽然不同点位具有不同的背景土壤和其它条件，这种方法允许对不同点位的长期变化趋势加以对比。对整合数据（概括了所有点位的ARG检测数据，包括点位B）的趋势加以总结，结果显示从1940年以来ARG丰度呈现出显著增加的趋势。这些趋势适用于所有类别的被测抗生素，并且这与每块点位标准化基因的变化趋势，以及基于整合ARG数据计算出的单一基因的长期变化趋势都较为吻合。

该结果进一步表明，包含ARG的土著细菌的相对比例随时间变化而显著增加，与1970~1979年时的水平相比，2008升高了2~15倍。值得注意的是其显示出比点位标准化基因变化趋势（p<0.05）更高的统计显著水平，这可能是因为速率系数是在更大的数据基础之上进行估算的。在单一ARG中，标准化的和整合的ARG丰度增加速率最快的是四环素[尤其是tet(Q)、tet(O)和tet(M)]以及β-内酰胺酶blaTEM-1。有趣的是，我们发现了CTX-M系列中超广谱β-内酰胺酶的升高（即blaCTX-M-1，见表S3），这比临床中遇到blaCTX-M-1问题的时间还要早，这表明抗性的决定子可能来源于土壤，这与我们前期的推测是一致的。

大部分被测ARG的丰度随时间变化而增加，而不同的基因和点位间依然存在着差异，这对了解某些特定点位中影响抗性基因长期保持的主要因子具有十分重要的参考价值。相应地，我们评价了多种“本地的”因素，包括土壤重金属浓度、土壤的吸附作用和排水特征、有机肥或其它化肥的施用水平、不同的灌溉方法，抑或是其他没有考虑到的因素。例如，测定了土壤重金属的含量，以确定在特定土壤中抗生素抗性的提高是否是由于已经存在的重金属导致的。然而长达68年的样品记录显示，土壤重金属浓度并未显著增加。实际显示在1940年到20世纪60年代末之间在金属浓度增加的同时ARG浓度也在增加，但此后金属浓度下降而综合ARG最大的趋势最大。

由于历史资料有限，我们的研究仅仅是定性分析，但是土壤类型、灌溉水源和类型、以及肥料使用等方面的差异在一定程度上可以暗示出影响ARG时空变化的主要因素。土壤样品采集时的目的并非开展本研究，点位上使用的其它化学物质、肥料应用的模式、灌溉水的水质和用量等重要的数据，或没有记录或已不可知。无论如何，做一些推论是可以的。例如，如果将1986年以前3个点位样品的ARG浓度加以比较，点位A和点位C的相对ARG浓度大致呈现增加的趋势，而点位B则没有。尽管这3块点位均接受灌溉水和肥料，但只有点位B的土壤是排水性能较好的沙质土，灌溉水也没有受到污染。作为背景参照点，点位A和点位C长期受到盐水入侵的侵扰，因此它们一直需要来自艾塞尔湖的淡水进行灌溉，而在20世纪80年代前艾塞尔湖水就受到生活垃圾和其它垃圾的严重污染。相反，尽管肥料施用记录不系统，但点位C有机肥的施用量比点位A和点位B高出近10倍。因此，基因的数据显示，很明显的一条结论是灌溉水水质（灌溉水和背景盐水）和土壤排水性能可能比有机肥的施用更加重要，这与我们最初关于有机肥作用的假设相反。大量的证据表明，有机肥的施用会向土壤中引入ARG；然而在研究长期影响时，灌溉水水质和排水似乎显得更加重要，这需要进一步的研究加以确认。

环境保护正在逐渐改善，那么为什么ARG水平仍然在升高？在我们的研究中，荷兰的某些特定的行为可能是这个问题的答案，尽管在世界上这样的地域性活动并不罕见。例如，尽管一再强调在农业生产中尽量不要使用抗生素，但1997年以来荷兰对抗生素的使用呈现出惊人的增长速度。在欧洲较为严格的制度的控制之下，荷兰出现这种现象的真正原因仍处在争论之中；然而，这种增长与点位D和点位E土壤中ARG水平的升高如出一辙，四环素更是如此。不论原因如何，近年来ARG水平的升高只不过是土壤中抗性基因明显增高这一现象的延续。回顾过去可以发现，不同的因素在不同的历史时期会显得格外重要或没那么重要，包括重金属污染、污染地表水的灌溉、海水入侵以及农业中抗生素使用量的增加等。总体上而言，我们的研究表明单一的修复方法不可能成功地减弱抗生素抗性增加这一趋势，这就需要能够同时针对多种原因的全面战略，在抗生素大量生产仍在继续的情况下更是如此。

本研究展示出了荷兰土壤中抗性逐渐增加这一趋势，研究结果也意味着在世界范围内开展更多的类似的研究。例如，本研究结果表明，我们可能遇到对抑菌剂疗法具有抗性的生物体的几率将日渐增高。随着遗传物质的水平交换以及细菌宿主多样化的增加，环境中的或共生生物体中的每一种潜在的外源抗性基因都会使病原菌获得抗性的机会大大增加。此外，由于土壤可以作为对土著微生物有益决定子的储蓄场所，即使将来抑菌剂的使用越来越谨慎，过去某个时段的抗生素和抑菌剂的暴露都可能对抗性基因库有着无法磨灭的影响，当然还需要进一步的验证。总体而言，本研究的数据表明目前还没有完全筛选出促进抗生素抗药性升高的环境因子，这就需要对抗生素抗药性、环境及人为因素的相互关联进行进一步的研究。国家医事委员会的报告“通往最小抗性之路”中说，“现在有一种不安的感觉，微生物种类越来越多，而治疗的方法的却越来越少”，本研究的结果也显示，土壤微生物逐渐增强的抗性可能会成为一个新的难题，它将对人类与全球抗生素抗药性间战争形成新的冲击。

张长波译自Evidence of Increasing Antibiotic Resistance Gene Abundances in Archived Soils since 1940.

《Environmental Science & Technology》, 2010, January, 15: 580~587.

土壤中抗生素抗性基因丰度不断增加

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