张宁，王凤山
(山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，山东济南250012
《中国海洋药物》试验方案 51protocol.com杂志2004年第2期(总第98期)
摘要:DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件。近年来一些新的或改进的DNA提取纯化方法不断出现，本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物提取DNA的方法进行综述。
关键词:DNA;提取;动物;植物;微生物;海洋生物
Advances of DNA extraction methods
ZHANG Ning，WANG Feng-shan
(Institute o f Biochemic and Biotechnological Drugs，School of Pharmacy，Shandong University,
Jinan 250012，China)
Abstract:DNA extraction is a basic technology of molecular biology. The purity and the integrality of DNA structure are necessary for different experiments of gene engineering. In recent years there have been some new or improved DNA extraction methods appeared. The methods of DNA extraction from animals，plants，microorganisms and marine organisms were summarized in this article.
Keywords:DNA;ex traction;an imals;plants;microorganisms;marineo rganisms
自 20 世 纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。DNA作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深人，在此基础上产生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA，为此针对不同来源的DNA建立了不同的提取纯化方法。本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物来源的DNA的传统提取方法及近年来诸多的改良方法进行综述。
1.动物来源的DNA的提取
1. 1经典提取方法
酚抽提法 、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。
1.2 玻璃棒缠绕法
该 法 用 盐酸肌裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个带钩的或前端为U形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸人TE中过夜，使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要求较高，但简单快速。
1.3 血细胞DNA的快速提取法
采用 非 离 子变性剂NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞，提取细胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。这样从血液中分离获得的DNA纯度高，能够满足各种临床检验和实验的需要。也可采用NP40和Tween -20同时作用破碎细胞膜，以避免SDS对以后步骤的负面作用。 Ba sun i等 [‘〕采用了4种常用的从血液中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 试剂盒法、QlAamp试剂盒法、Tri- PureTM试剂分离提取法以及经典酚抽提法，对通常作抛弃处理的血凝块进行人DNA 及病毒DNA的抽提，发现前两种方法可以迅速高效获得目的DNA，从而建立了由血凝块中提取DNA的方法，扩大了临床检验样本的来源。
1. 4 玻璃颗粒吸附法
在该 法 中首先利用含异硫氰酸肌的细胞裂解液裂解细胞，然后加人含有能够与DNA 结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合染色体DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以与DNA 进行结合，一定大小的硅胶颗粒也可以与 DNA进行结合，据此，不少实验工作者实践了很多利用颗粒结合DNA 的提取方法。 Pichler等[2〕在从抹香鲸(Physeter macrocephalus) 牙齿及骨骼中抽提DNA时采用了一种以二氧化硅为吸附介质的方法，从抹香鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了足够用于分析的DNA产物，此方法扩大了对稀有哺乳动物DNA研究的取材范围。 Caldarelli-stefano等[3〕在从福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织标本中提取DNA时利用小磁珠作为结合核，也获得了理想的纯化 DNA。很多试剂公司也依此设计生产了许多颗粒提取试剂盒，Pint。等[4]就探讨了采用 Gibc。公司的GlassMAX系统，对福尔马林固定的组织进行DNA提取的具体操作方法，目前这些试剂盒在临床上广为应用，省时省力。
1.5 三乙醇胺月桂基硫酸盐(TLS)法
由于 常 规 方法中使用的蛋白酶K的水解条件不好掌握，采用TLS来提取组织、细胞以及外周血DNA可以克服这一弊端。 TLS是一种较强的表面活性剂，将其直接作用于细胞或组织匀浆，可迅速溶解细胞膜、核膜，而且蛋白质与其结合后即失去对DNA 的结合，进一步的纯化可采用常规方法。
1. 6 临床病理标本的DNA提取方法
由于 PC R技术不仅可用于基因分离、核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控研究、基因病的诊断及肿瘤发生机理的探讨等。近年来，PCR技术已广泛应用于病理学研究，尤其对福尔马林固定石蜡包埋病理标本进行相关的研究更成为关注的焦点。对于从这些病理标本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，该法虽然效率较高，但费时费力，而且其操作中要求多次离心，增加了样品污染的可能性。近年来很多高效灵敏的方法在实践中得以采用，这些方法通常采用加热或微波法〔s〕去除包埋的石蜡，使用Sephadex G- 5。柱色谱或盐析法[s7等去除蛋白质。高文涛[71等在研究福尔马林固定石蜡包埋组织 DNA提取方法对PCR的影响时，发现在组织切片中加人鳌合树脂(Chelating Resin，亚氨基二乙酸)提取获得的DNA可取得较好的PCR扩增结果。Coombs等〔s〕则采用热循环方法，将标本上的蜡融人样品溶液，在酶的作用下进行裂解，然后用Chelex-100进行吸附，离心去蜡，这种方法安全、简便、有效、经济。
1.7 盐析法
该 法用 饱 和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的DNA质量可以满足PCR模板的要求，但产率相对较低，纯度较差。谭建明等[9]对上述盐析法进行了改进，即将处理过的样本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C 消化1h，然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质，并经离心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。该法简化了DNA的抽提步骤，可用于人体各种样本DNA的提取，所获DNA的纯度可以满足各种检测的需要。
2 植物来源的DNA提取
利用 基 因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程操作离不开植物基因组总 DNA的制备，不同植物的核酸结合蛋白的情况各不相同，因而要采取不同的提取方法[10]。由于植物中次生代谢产物― 多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物DNA纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等酶类的生物活性。因此要从富含多酚和多糖的植物组织中分离获得高质量的基因组 DNA也并非易事[11l。目前采用的方法有以下几种。
2.1 十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法
CT AB 是 一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA和多糖分开，再用乙醇沉淀DNA 而除去CTAB。在该法中使用的聚维酮 (PVP)与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的DNA降解[121。王卓伟等[13〕在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVI〕还能有效地去除多糖。罗志勇等[14〕在研究中对这种方法进行了几点改进: ①提高CTAB的浓度;②对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中琉基乙醇的含量，同时加人PVP使其与多酚类物质结合形成复合物;③增加低盐沉淀缓冲液的量;④增加高盐溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA, Porebski等[1s]在沉淀粗提 DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5m o卜L-’以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等[16] 对传统的CTAB法进行了优化，创建了一种从新鲜草本植物样本中提取DNA的方法。首先在特制的有96个孔的托盘上种植植物样本，并依照不同样本在托盘中的位置进行编号，然后取适量植物叶子分装在充满提取液的塑料袋中，除去袋中的空气并封口，再用特制的手工匀化器将各袋中的样本混匀，56`C孵育 1h后将袋中的液体取出进行离心以及DNA 的沉淀。Xin等〔17〕则采用简易的96孔托盘作为提取时的容器，将多种植物样本经研磨处理后分别放在不同的孔中进行提取，在一天内由一人就可完成上千个样本的DNA提取，为高通量植物基因分析及筛选提供了极大的便利。
2.2 SDS法
为 了避 免 CTAB法试验步骤多、操作繁琐的不足之处，近年来又提出了利用SDSTris- Cl-- EDTA等直接裂解细胞使其释放出DNA的方法[18]。在该法后续的DNA纯化过程中通常采用酚/氯仿处理，但对于植物 DNA纯化不是一个很好的选择，因为酚的使用可降低DNA的提取效率和纯度。王景雪等[19〕在用该法提取DNA的过程中采用较大的离心力和较长的离心时间，然后用氯仿一异戊醇代替酚来去除变性蛋白质，从而克服了由于酚的掺人及残留对以后酶切带来的困难。杨婉身等[201用琉基乙醇代替SDS，对大豆DNA分离提取能够更有效地去除蛋白质，而且可以有效防止褐变，获得天然双链高分子量的DNA产物，并且减少了SDS对 PCR、随机扩增多态性DNA技术(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的影响。王得元等[z1〕在对辣椒DNA进行提取时为了提高DNA的产率将待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且针对辣椒叶子中多酚类物质极少的特点将其中的加人PVP的步骤省去，消除了PVP对以后操作的影响.
2.3 氯化千法
李思 光 等 (22〕在对称猴桃的基因组DNA 提取过程中选用了氯化节法，与其他方法相比该法的得率较高，其原因可能是氯化节不仅可与植物细胞壁上的多糖经基反应生成醚，而且与细胞液中多糖物质的All基反应，起到破坏糖链的作用，利于DNA的释放和提纯。
2.4 高盐低pH法
该 法 中 所用的提纯试剂仅为无机盐和异丙醇。通常采用的无机盐为醋酸钾，低pH的醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂。与一般氯仿一异丙醇反复抽提去除蛋白质的操作相比该法操作更方便省时，所需样品量少，适用于
濒危植物DNA的提取。
2.5 果胶酶法
Ste ve n等 [2s采用果胶酶对植物细胞破碎后的抽提混合物进行消化处理使与DNA共沉淀的胶状物质分解成小的片段，从而无法与DNA一起沉淀下来，降低了DNA的纯化难度，提高纯化效率。
3 微生物来源DNA的提取
常规 的微 生物DNA提取多是根据某种微生物的具体特点选择合适的方法。在实际的科学研究过程中，很多科学工作者通过实践总结出许多快速实用的提取方法，现择其中比较典型的加以总结。
3.1 细菌质粒的提取方法
质粒是独立于细菌染色体DNA之外的环状DNA，它能携带外源基因进人细菌进行扩增，或表达外源基因，是基因工程中常用的载体，在DNA重组技术、DNA测序、转基因等方面具有广泛的应用。对于细菌质粒的提
取比较经典的方法有:碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。这些方法的选择取决于质粒的大小、细菌菌株的性质等。Keunosky等GE_发展了一种以 Zn'+诱导DNA沉淀的方法，在该法中利用一定浓度的ZnCl:溶液使一定体积的细菌菌液质粒DNA大量沉淀，无需多次离心，大大简化了抽提的步骤。
近年 来 ，一些生物技术公司，比如Promega公司及Qiagen公司等纷纷推出质粒抽提试剂盒，这些试剂盒多运用树脂材料或硅胶来特异性的吸附质粒DNA，提取过程用时少，效率高。
3.2 真菌DNA提取方法
对 真菌 DNA的提取关键是破碎细胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷冻处理增加细胞壁脆性的物理破壁法。在这两种方法中酶解破壁法较为简单，易于操作和控制，而物理破壁法在处理过程中容易造成细胞核的大量破损。在提取获得核酸一蛋白质复合物后，对其中蛋白质的沉淀也多采用传统的氯仿一异戊醇沉淀法或高盐沉淀法。韩利刚等C25用CTA13法直接从丝状真菌的新鲜菌丝中提取DNA，并将所提取的DNA进行 RAPD，得到了较清晰的扩增图谱。Loeffler 等[Z6为满足快速灵敏准确的临床检验的需要，利用MagNA Pure LC系统建立了一种实用的快速提取方法，该法自动化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等[z7〕在对真菌进行DNA抽提时采用几个循环的快速制冷、煮沸以破碎真菌细胞壁，并通过Qiagen 公司的QIAquick DNA纯化柱，迅速从极微量的真菌中获得高纯度的DNA大分子。
3.3 结核杆菌DNA的提取方法
利用 PC R微孔板杂交技术检测临床标本中结核杆菌DNA是诊断结核杆菌感染的一种快速灵敏和特异的方法。从不同的临床标本中获得DNA是检测准确和成功的关键。而不同来源的结核杆菌又分别受到不同来源材料的影响，所以提取方法各不相同。同时由于结核杆菌的细胞壁比较厚不易破碎，一般的微波法、异硫氰酸肌法、冻融法等难以破坏结核杆菌的细胞壁。通常采取的方法有:经典酶一酚一氯仿法，碱一SDS裂解法，碱裂解煮沸法，超声裂解法，Chelex-100 法，玻璃粉一硅吸附法等。杨正林等[28〕通过对以上几种方法的比较发现玻璃粉一硅吸附法操作简单，假阳性低，适合临床检测使用。
3.4 土壤微生物总DNA的提取方法
土壤 中 细 菌的含量丰富，种类齐全，从中提取细菌DNA可用于检测不可培养的细菌，跟踪某些目标菌或重组基因在自然环境中的行为，也可用来解释土壤微生物生态系统中的基因的多样性及其随环境的变化。从土壤中提取和纯化DNA是最关键的技术之一。 Courtoi:等[29]对比了在土壤中直接裂解微生物体、然后提取DNA和先将微生物菌体通过梯度离心与土壤颗粒分开再进行提取的方法，利用PCR技术以及杂交技术检测不同方法获得DNA的种类和纯度，发现前一种方法具有更高的效率，能够提取获得较多微生物物种的 DNA。张瑞福等[30]采用SDS高盐提取法和透析袋回收法对9种不同来源的土壤进行微生物DNA的提取，与通常采用的对菌体细胞的超声破碎法以及对粗提DNA的微型柱纯化法相比，既保证了一定提取与回收效率，又兼顾了DNA的质量，使DNA在提取和纯化过程中不会受到损伤。
4 海洋生物DNA的提取方法
海洋 是 地 球上最大的生物资源库，同时由于海水的保护使海洋生物变化很少，物种得到较好的保存，这样就为研究生命现象的基本问题提供了丰富的资料。在利用这些资源探讨诸如生命的起源、生物进化、生物与环境的关系、改造海洋生物以为人类服务(如生产某种药物)时离不开对生物核酸的研究。对于海洋来源的动物、植物、微生物由于其不同于陆生生物的组织和细胞结构特点往往采用不同的DNA提取方法。
张海 琪 等 [31_在对不同方法保存的大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肌肉样品基因组 DNA进行提取时发现，经福尔马林、乙醇及含有EDTA的乙醇保存的样品可以同鲜活样品和冷冻样品一样获得基因组DNA，但相比之下采用乙醇作为固定剂更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，获得了满意的效果。杨文新等[32〕利用75%的乙醇固定鲍鱼(Haliotis discus)样本并进行DNA的提取，证明用乙醇固定海洋动物组织是一种切实可行的方法，材料处理后可同步提取，增加了实验的同步性、可比性，适用于大量样本的提取。由于组织中含有许多DNA酶，绝大多数DNA酶需要一个二价阳离子作为辅助因子，因此采用含适量EDTA的乙醇固定剂是野外标本采集和运输的一种更简便有效的方法。
韩兵 社 等 33:针对传统的有机溶剂提取工艺进行改进，应用多种萃取液体系从废弃物鱿鱼肝脏中提取核酸，与原工艺相比，核酸提取产量提高30%-60%，整体工艺得到简化，而且避免了有机物的残留。
赤 潮 是 在特定的环境前提条件下，海水中的某些浮游生物、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象，对海洋渔业、水产资源以及人类的健康造成很大的威胁。发生赤潮的生物类型主要为藻类，铜绿微囊藻(Microcytis aeruginosa) 是造成赤潮的藻类之一。陆源等[34〕用乙醇乙醚混合液对纯化的铜绿微囊藻作预处理，破坏了其胶质鞘，从而使蛋白酶K和 SDS能更好地直接作用于其细胞壁，细胞内的DNA释放完全，提高了总DNA的得率。通过提取获得的DNA有助于开展对有害藻类的研究，为防范赤潮提供依据。
在对 紫 菜 (Porphyras p.)进行DNA提取时，郭宝太等[35〕先用海螺酶处理样品制备紫菜体细胞，然后用SDS和蛋白酶K裂解细胞提取总DNA，再用Wizard DNA clean-up;树脂进行纯化。经海螺酶处理的紫菜细胞解决了通常采用的液氮破碎细胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有严重的多糖污染等难题。但这种方法对植物组织需求量较多，不适于个体体积小的紫菜。刘必谦等[36〕采用美国Roche公司的DNA Isolation Kit for Cell and Tissue和上海生工公司的UNIQ- 10小量柱式基因组DNA提取试剂盒对个体体积较小的圆紫菜(Porphyra suborbiculato )、铁钉菜(Ishige okamurae)等进行DNA 的提取，获得高纯度的基因组DNA，完全能满足酶切片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技术的需要。
陈子 桂 等[371以海洋尾丝虫(Uronema marinum)为材料，针对纤毛虫难以建立培养以及个体丰度不高等特点，就微量条件下提取DNA的方法进行了探讨，成功地获得了活体直接提取、活体酚/氯仿抽提、固定标本直接提取以及固定标本酚/氯仿抽提等四种简便有效的微量DNA提取方法，解决了纤毛虫微量DNA提取的困难。
综合 DN A的提取方法，虽然不同生物 DNA的提取方法不尽相同，但各种提取方法也有很多相通之处，可以相互借鉴。随着生物技术的飞速发展，对这一技术的经验总结将会越来越多，一些生物领域新的DNA提取方法也将逐渐固定下来，更为简捷、高效的方法也必将出现，为基因工程提供更高纯度的DNA.
