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简介
土壤样品含有大量的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取DNA 是研究土壤微生物最为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物DNA 的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA 全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取，如Zhou 的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS 等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA 的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取DNA 可最大可能性地获得全基因组，但是这种方法却面临以下几个问题：
1. 腐殖酸的污染。土壤中，特别是森林，草地土壤含有非常丰富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常类似，在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用，如PCR，酶切的失败。
2. 裂解方法。土壤样品中含有各种微生物，如细菌和真菌等。革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁，让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组DNA 的关键。由于土壤样品的复杂性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蜗牛酶)或液氮研磨都不可行，因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。
3. DNA 得率难于控制。土壤样品或因肥沃，或因贫瘠，或因含水量丰富，或因干枯，或因取样的深浅度，都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA 含量往往会差别成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化学成分，如重金属盐，粘土物质都会造成DNA 得率降低。Magen 公司的HiPure Soil DNA Kit 采用硅胶柱纯化技术，是专门为土壤DNA 提取为设计的。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法，可不需特殊的珠磨仪，在涡旋仪就可进行，适合于广大的研究室。试剂盒中Absorber Reagent 是Magen 公司独家开发的腐殖酸吸附剂，能高效去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式，可高效去除土壤中各种可溶性金属盐，以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤(部分是客户反馈)：自然保护区森林的土壤(长达30-40 年森林土壤，表层有30-50cm 落叶层)，红树林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，矿石区泥土，有机物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空调管道堆积物等。
实验方法
为表明该试剂盒的优势性，我们选择以下不同组织样品进行DNA提取实验，每个样品重复3 次。
l 森林类样品：自然保护区森林土壤(广东黑石顶自然保护区)和海南岛红树林保护区
l 矿石区样品：矿石区水底土壤(湿)和矿石区地表土壤(干)
l 耕地样品：稻田土壤，菜地土壤
l 有机物污染地表样品：污水沟衍泥和生活垃圾堆放区
操作方法（按HiPure Soil DNA Kit 试剂盒进行）简单描述以下：
1. 取0.5g 土壤到2ml 匀浆管中。加入0.9ml Buffer SOL/SDS，高速涡旋5-10 分钟裂解细菌或真菌。
2. 70oC 水浴10 分钟进一步裂解细菌。
3. 加入0.3ml Buffer PS 涡旋混匀；
4. 加入0.3ml Absorber Solution，涡旋混匀。
5. 13,000xg 离心5 分钟。
6. 取上清。加入结合液混匀后上柱。
7. 洗涤柱子三次。
8. 加入适当量的Elution Buffer 洗脱即可。
实验结果
1. DNA 电泳结果
取10 ul 纯化的基因组DNA 上样于0.8%琼脂糖凝胶，80V 电泳30
分钟，结果如下。
0.5g 森林类土壤样品
(前两个自然保护区森林土壤，后两个为红树林土壤)
0.5g 耕地类土壤样品
A: 水稻田土壤 , B: 玉米土壤
A: 生活垃圾堆放地 , B: 污水沟底泥
1 和3 是两个矿石区水底土壤(湿)
2 和4 矿石区地表土壤(干)
2. DNA 纯度和产量分析
土壤类型 A260 A280 A230 A260/A280 产量ug
1 0.1792 0.1041 0.1075 1.7 9
2 0.2107 0.1195 0.1257 1.8 11
3 0.1244 0.0730 0.0759 1.7 6
4 0.1477 0.0855 0.0900 1.7 7
5 0.2640 0.1739 0.2149 1.5 11
6 0.2584 0.1521 0.1579 1.7 12
7 0.0595 0.0390 0.0414 1.5 3
8 0.0190 0.0121 0.0623 1.6 1
1. 红树林土壤,2 .自然保护区森林土壤 3.玉米土壤, 4.水稻田土壤矿石区地表土壤(干) ,5.污水沟底泥,6.生活垃圾堆放地, 7.矿石区水底土壤(湿), 8. 矿石区水底土壤(干)
3. PCR 结果分析
各种样品DNA 作模板，扩增细菌16s 基因的电泳图
M.100bp DNA Ladder,1.阴性对照 2.红树林土壤,3.自然保护区森林土壤 4.玉米土壤, 5.水稻田土壤矿石区地表土壤(干) ,6.污水沟底泥,7.生活垃圾堆放地, 8.矿石区水底土壤(湿), 9.矿石区水底土壤(干) 10.阳性对照,大肠杆DH5a 基因组.
产品信息
CAT.No Preps Prices
从小于0.5g 土壤样品中分离DNA
D3142-02 50 1158
D3142-03 250 5490
从小于10g 的土壤样品中分离DNA
D3143-02 10 868
D3143-03 50 4125
试剂盒的内容：
l Buffer SOL, Buffer SDS, Buffer SP, Buffer BD, Buffer GW2,Elution Buffer, Absorber Reagent
l
HiBind DNA Mini Column, 2ml Collection Tube
l
2ml 匀浆器
常见问题分析
1. 试剂盒是如何进行破壁的？
答: 该试剂盒采用高浓度SDS 裂解液和珠磨法进行破壁。土壤中含有细菌和真菌，以及其它微生物。大部分革兰氏阴性细菌在SDS裂解液中可快速发生裂解，革兰氏阳性细菌和真菌是SDS 裂解液中是不会裂解的。采用玻璃珠高速涡旋或使用珠磨仪可有效裂解细菌和真菌。此外，试剂盒还进行热激(70oC 或90-95oC)步骤，以确保这些微生物的有效裂解。为了比较不同的破壁方法，我们选择四种森林土壤(1,2,3,4)，然后采用不同的方法(A,B,C,D)进行破壁。结果以下。结果表明，使用珠磨仪(A,C)匀浆能得到最高的产量，但1号样品因没有加热而得不到DNA。使用手工涡旋和液氮研磨，辅助加热都可以获得较高产量的DNA。
A：Fastprep-24 珠磨仪 C: 2000 Geno/Grinder 珠磨仪
(A,C 珠磨仪结束后，没有加热步骤)
B: 用玻璃珠，在点动涡旋仪上涡旋3 分钟，再70oC 加热处理;
D: 用液氮研磨，再70oC 加热处理。(1,2: 红树林土壤，3,4: 森林
土壤)
2. 加热过程对产量提高有多大？是选择70oC 还是95oC 加热？
答: 加热过程对某些土壤是相当关键的。我们的实验表明，某些土壤经高效珠磨仪Fastprep-24 处理后，70oC 处理10 分钟可提高3-4 倍的DNA 产量。某些土壤对加热并不敏感。90-95oC 处理10分钟可提高10-30% DNA 的产量，对一些特别难裂解的细菌(如金黄色葡萄球菌)，95oC 热激非常重要。但是95oC 处理会引起DNA 的降解。我们建议需要检测难裂解细菌或真菌才进行95oC 处理。
左图结果表明: 高温处理(95oC)可以提高产量，但是会引起DNA 的降解。右图表明，在灭菌的土壤样品中接种金色葡萄球菌后，只有95oC 处理可能获得其DNA。
3. 如何提高土壤DNA 的产量？
答：土壤样品中所含的微生物种类，微生物的数量，以及土壤样品中的有机，无机盐都会直接影响到DNA 的产量。如下几种方法可显著土壤中DNA 的产量。
l 土壤中微生物含量低： 提高土壤用量至1-2g。提高土壤用量时，必须相应地提高Buffer SOL, Buffer DS Buffer PS 的用量。
l 土壤中存在DNA 吸附物质： 加入脱脂奶粉。如何土壤样品因含有粘土，硅胶盐等有机物，这些有机物会吸附核酸而造成DNA 产量过低。可以在Buffer SOL 中，加入脱脂奶粉至8-40mg/ml，以减少对核酸的吸附；
l 土壤中含有重金属盐：提高土壤用量至2-5g。土壤中的某些可溶性的二价或三价金属盐会絮凝DNA 而导致DNA 的损失。举例来说，在DNA 溶液中，加入Al3+或Zn2+等离子时，DNA 就会立即同这些金属离结合形成不溶解的物质。处理该类型样品时，可以在Buffer SOL 中加入特殊金属络合剂，如EGTA 等。(Buffer SOL 中已含有高浓度的EDTA)。或提高土壤用量。
4. 为什么DNA 电泳拖尾严重？
答： 这是由于DNA 降解形成的。造成DNA 降解的原因有如下几点：
1) 土壤中含有丰富小型生物和易裂解的细菌。这些易裂解的小型生物和细菌在玻璃珠长时间涡旋中就会造成DNA 降解。解决方案就是减少涡旋时间，或用高能量的珠磨仪代替手工涡旋。(高能量的珠磨仪能提供非常高的能量，在短时间就可以达到破壁效果，因而能减少DNA 的降解)
2) 样品中存在某些化学物质，或样品在贮藏过程中发生降解。
5. 加入异丙醇沉淀时，为什么会形成一大堆沉淀？
答：土壤样品含有各种无机或有机分子，其它大部分的无机分子，如金属盐都是水溶性的。加入异丙醇沉淀时，水溶性金属盐的溶解度下降就会析出形成沉淀物。处理矿石区的样品时常常会碰到这种现象。使用该试剂盒时可去除这些水溶性金属盐的污染。
6. Absorber Reagent 去除腐殖酸的原理和效果？
答：Absorber Reagent 是pH 依赖性的腐殖酸吸附剂。 该吸附剂在pH8.0 的缓冲液中能高效特异性地吸附腐殖酸。AbsorberReagent 吸附剂在pH7.0 以下，也会吸附核酸DNA。因此，DNA必须采用Elution Buffer 或Buffer TE(Ph8.0)来溶解。
(处理前)
(Absorber Reagent 处理后)
由图可知，在Absorber Reagent 处理，粗制的土壤DNA 中含有大量的腐殖酸的污染，颜色很深；Absorber Reagent 处理后，DNA的颜色消失了，表明腐殖酸已经被去除。
7. 该试剂盒还可以通过何种方法进行优化?
答： 由于土壤样品百差万别，不同的土壤样品对预处理的方式都有不同的效果。试剂盒采用SDS 裂解液和玻璃珠研磨对土壤样品进行裂解和预处理，这种方案可能对某些样品是没有效果。此时，用户可按自已的方案或其它方案对土壤的DNA 进行粗提取，然后再按试剂盒的第9 步，加入HTR Reagent 吸附去除腐殖酸，过柱进一步纯化。
8． HTR Reagent 处理后，DNA 样品颜色还是很深？或使用该试剂盒得到的DNA 还是有颜色的，怎么办？
答： 这种样品往往是森林土壤，特别落叶层很厚的土壤。这种土壤因落叶的分解而积累丰富的腐殖酸。HTR Reagent 吸附腐殖酸有一定的饱和度，过多的腐殖酸就会残留。可重复一次HTR Reagnet的吸附步骤。
9． Absorber Reagent 处理后，DNA 样品颜色还是很深？或使用该试剂盒得到的DNA 还是有颜色的，怎么办？
答： 这种样品往往是森林土壤，特别落叶层很厚的土壤。这种土壤因落叶的分解而积累丰富的腐殖酸。Absorber Reagent 吸附腐殖酸有一定的饱和度，过多的腐殖酸就会残留。可重复一次Absorber Reagent 的吸附步骤。
10． 该方法可以获得所有微生物的DNA 吗？
答： 不一定。土壤样品中含有大量的微生物，有细菌和真菌，以及其它植物根系，小型生物。某些真菌类，特别孢子类真菌，因带有非常厚的细胞壁，无法破壁而导致其DNA 的丢失。若需要提取这些难提取微生物的DNA 时，我们建议加强破壁的强度和时间。
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