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LONZA内毒素检测－LAL 试剂 （点击进入）
动态浊度鲎试剂使用说明 概述：
鲎试验是一种最灵敏和专一的内毒素检查方法，它是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，通常称为热原。鲎试验的原理是内毒素与LAL反应可形成易于分辨的凝胶。简单、经济的的鲎试验使得它已广泛应用于半成品、原材料以及药品、医疗器械和生物制品等产品的检查。美国药典的细菌内毒素检查法和美国FDA指南为有效验证鲎试验法代替兔热原法提供了标准方法。
借助电脑和微孔平板仪或试管仪，可以进行动态比浊法试验，可精确地检测出已设定的浊度。设定浊度的反应时间与检品中的内毒素的量成反比，因此未知检品中的内毒素水平是通过与标准曲线的比较来确定的。用动态测量，λ是标准曲线中的最低点。
生物原理
Frederick Bang观察到细菌导致美洲鲎血管内的血液凝结。在协作研究中，Levin和Bang发现导致凝结现象的因素存在于鲎的阿米巴细胞中或循环血液细胞中，热原（细菌内毒素）触发浊度和凝胶形成酶促反应。
美国FDA终产品检测指南：
美国食品与药品管理局在1987年发布了一份准则，通知生产人用药品和生物制品、兽用药品和医疗器械的厂商，FDA认为有必要用于验证鲎试验作为终产品的内毒素检测方法的程序，那些遵照鲎试验准则的厂商将被认为符合CGMPs有关规定。非经肠道药品的通用内毒素限值是5个内毒素单位（EU）每公斤剂量，但鞘内药品的限值是0.2EU/Kg医疗器械浸取液不得超过0.5EU/ml；与脑脊髓接触的器械的限值为0.06EU/ml。必须根据FDA的鲎试验指南（1987）的补充规定（1991）“临时指导原则”进行动态浊度分析。
鲎试剂：冻干的浊度试剂含有用单价和二价阳离子加以稳定的缓冲过的鲎阿米巴细胞溶解物。灵敏度，λ是参考美国标准内毒素EC-5标定的，用EU/ml标示。它是EU/ml表示的RSE的最低浓度并在标准条件下产生凝胶。
复溶：将试剂瓶在一坚固的表面轻弹使瓶中的鲎试剂粉末落到瓶底。小心地移开盖子释放真空，避免接触污染。残留在胶塞上的少量试剂是无关紧要的。在使用前立即用5.2毫升的无热原水复溶试剂，用移液棒将水直接加入瓶中，不立即使用时用无热原封口膜盖住瓶口，轻轻搅动直到鲎试剂溶解于无色溶液中。如果封口破损或出现颜色或混浊则将它们丢弃。
贮存：冻干的鲎试剂在热的条件下还是相对稳定的，但还是应存放在2-8℃下；避免长时间放置在高于25℃的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放在一冰冷的表面上或2-8℃的冰箱里存放24小时以内，否则在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下，可存放28天，鲎试剂只能冻融一次。
ACC可提供E.coli内毒素工作标准品（CSE）用于复核试剂的灵敏度、验证产品检测方法和制备抑制对照管（阳性水和阳性产品对照），参考每一批CSE的分析证明中关于效价、复溶和贮存的信息。该批产品必须另外订购合适的CSE。
必须用LAL检查用水（无LAL活性）复溶鲎试剂和制备样品、对照管和内毒素标准品，该批产品必须另外订购合适的LAL检查用水。
警告和预防
警告：浊度法试剂只用于体内诊断，使用时须小心因为其毒性仍不为人所知。
正确应用该检测方法要求严格遵守推荐程序中的所有项目，LAL原始记录中必须包括阳性对照以检测抑制条件。所有与样品接触的材料或检测材料必须是无热原的，玻璃器皿必须经有效除热原，（我们的经验是标示已灭菌和处理的塑料制品是无热原的。那些不能经高温灭菌的材料或销售时没有无热原标签的材料应小心检测其是否含内毒素）。
样品的采集和制备
所有与样品或检测试剂接触的材料必须是无热原的，在任何时候都要使用无菌技术。由于鲎试剂-内毒素的反应是与pH值有关的，样品-鲎试剂的混合物应产生6.5-8.0的pH值。如果需要调节pH值，使用无内毒素TRIS缓冲液，不要随便调节未缓冲溶液的pH值因为ACC配方已经缓冲过。
产品干扰
每一样品的检测方法必须经过验证证明无明显的干扰，抑制通常与浓度有关，可用LAL检查用水稀释来克服干扰。抑制的普遍来源包括1）干扰酶介反应的和2）改变内毒素（阳性）对照的分散性。
最大有效稀释：美国食品和药品管理局规定经静脉给药的药品的内毒素限值为5EU/kg，鞘内药品为0.2EU/ml。但对于一些简单的药品也采用特殊限值，这些限值可以用来确定稀释的范围以克服干扰问题而不会超过限定的内毒素浓度，最大有效稀释（MVD）是按照以前提到的文件和其它药典中提供的公式来计算的。
对于有公布限值的药品，MVD可按下列公式计算：
MVD＝ 内毒素限值×产品效价
灵敏度
例如，环磷酰胺的内毒素限值是0.17EU/mg，如果使用最低内毒素水平为0.05EU/ml的标准曲线来检测效价为20 mg/ml的产品，MVD等于1:68,这样, 环磷酰胺可最大稀释到1:68以解决潜在的抑制(一份样品比68份无热原水)
用动态法进行干扰（抑制/增强）检测试验是用已知浓度的内毒素强化或稀释样品并根据供应商的说明重复两管检测其峰值回收率，这个试验要求用RSE或CSE制备的标准曲线（参阅CSE的分析化验证明），标准曲线至少应包括三个RSE或CSE浓度，还应包括另一标准品以分辨在标准曲线范围内的每一个10倍稀释的增长。曲线必须符合“试验特征”中所述的标准。
选择标准曲线的中点做干扰检测，例，范围为5至0.05EU/ml的标准曲线的阳性产品对照浓度是0.5EU/ml。（见日常检测）
强化的药品的内毒素含量均值，参考标准曲线时，如果在±50%以内则认为无干扰，回收率不在
±50%以内表明样品受到干扰，用无热原水继续稀释样品直到获得有效的回收率，但不能超过MVD。另一种检测干扰的方法是4l内毒素回收率在±50%以内。
动态浊度检测程序
可在有以下功能的试管或微孔平板仪上用KTA2作动态浊度分析：A）可测量相对于时间的光密度值的变化的检测系统B）微电脑和相应的软件通过线性回归分析信息。
每个试验应包括样品或稀释的样品或产品、阳性产品对照管，包含设定的标准曲线的一系列稀释或阳性水对照管和一阴性对照管，至少重复两管检测，按照自动内毒素测量系统提供的指导进行操作。
方法：无菌地将0.1ml的每个样品移到微孔平板的每个孔底，在准备鲎试剂的添加的同时将平板至少预热10分钟；否则遵照仪器供应商的说明。然后用配量器快速将0.1ml的鲎试剂加入每个孔中，先加阴性对照，最后加最高的内毒素浓度。如果平板仪不能自动混合溶液，轻拍平板侧面几次并及时启动定时观察，期望的监控阶段结束后，启动结果的分析程序。
要求的试剂/材料但不供应：
微孔平板，可任意处理并已除热原
玻璃稀释试管，无热原
独立包装的移液器，灭菌移液针头
灭菌移液棒，独立包装，用无菌吸头自动吸取液体
旋涡混合器
平板仪或试管仪
日常检查
用双对数标准曲线作日常检查是最有效的；每个检查的标准曲线应包括至少三个内毒素浓度，重复两管检测，例如5，0.5和0.05EU/ml。对于半成品或原材料的检测，从5至0.005 EU/ml的四个数量级的标准曲线可能更合适。当标准曲线具有较好的一致性时，可制作存档曲线，按《临时鲎试验指南》中所述，使用三次检测的标准曲线；若使用存档曲线，阳性水对照在该曲线上的固定值平均数误差须在±25%范围。
阳性产品对照（PPC）应含有等于标准曲线中点的内毒素浓度，例如上面介绍的0.5EU/ml。参考临时鲎试验指南来选择PPC，PPC的内毒素浓度平均值必须落在±50%的相应的标准曲线浓度范围内，确证污染的测定时应做内毒素标准品系列。ACC推荐的有效的强化技术是直接将内毒素加入检品中强化，用这一技术制备阳性产品对照的过程是在加入显色试剂前将10μl的5.0 EU/ml的CSE加入到已含100μl检品的微孔平板的孔中。
结果
内毒素浓度的计算
在整个检测过程中，试管仪或微孔平板仪监测吸光度的增加，仪器记录吸光度明显增加所需的时间，通常是0.050至0.200 光密度单位，这一时间称为反应时间。仪器软件自动形成每一标准品的反应时间与它相应的内毒素浓度的双对数标准曲线，然后显示标准曲线的特征并评估确定该分析是否有效。下面列示了一标准系列和样品产品中的0.5EU/ml内毒素的回收率。
代表性线性分析
样品 CSE（EU/ml） 平均反应时间（秒） 回收率（EU/ml）
STD1 50.0 337
STD2 5.0 493
STD3 0.5 801
STD4 0.05 1400
STD5 0.005 3025
ACG.SPL1 --- **** <0.005
AVG.PPC 0.5 822 0.706(141%)
回归等式：Log(y)=-0.236Log(x)+2.879
相关系数：g = -0.991
在这个例子中，每个样品（SPL）的阳性对照（PPC）的内毒素回收率表明无抑制。
阴性对照的内毒素浓度应明显低于最低的标准内毒素浓度。
如果相关系数的绝对值大于0.980，可用一多项回归模式来描述标准曲线。多项回归模式的计算是为使用WinKQCL、Biolise或此类软件的用户准备的。请参考有关软件手册和以下描述多项式回归模式的部分。
多项回归模式
如果线性相关系数大于或等于0.980，多项回归模式适用于标准曲线。
注：多项标准曲线不能用于初次质量检测。根据管理条例，对于这种检测FDA只接受线性回归模式。
上面的例子用四个项（五个标准）进行分析，将得出以下结果：
多 项 分 析
样品 CSE（EU/ml） 平均反应时间（秒） 回收率（EU/ml）
STD1 50.0 337
STD2 5.0 493
STD3 0.5 801
STD4 0.05 1400
STD5 0.005 3025
AVG.SPL1 --- **** <0.005
AVG.PPC 0.5 122 0.445(89%)
匹配的回归等式:
Log(y)=0.0031*Log(x)4+0.001*Log(x)3 +0.011*Log(x)2-0.216*Log(x)+2.837
线性相关系数: g = -0.991
程序的局限性
如果不出现用可接受的稀释（参考MVD计算）或样品预处理，如缓冲，可消除的抑制或增强因素，样品可用鲎试验方法检测，如果鲎试验方法不能在最大有效稀释的浓度内进行验证，则不能用鲎试验代替美国药典热原检测方法。
试验特征
斜率：在用于确定内毒素水平的浓度范围内的标准曲线的斜率必须经过验证，至少应检测三个内毒素标准品，重复三管检测。相关系数g应大于或等于0.980的绝对值。
动态浊度的质量控制过程
遵照FDA鲎试验指南关于终产品检测的凝胶法质量控制过程包括增加理论浓度在±50%范围内的阳性产品对照。标准曲线必须有一个≤-0.980的相关系数。
用ACC的浊度法试剂验证过的检测方法不需要用KTA2重新验证。
当标准曲线具有较好的一致性时，可制作存档曲线，使用三次检测的标准曲线；若使用存档曲线，阳性水对照在该曲线上的固定值平均数误差须在±25%范围。
期望值
浊度法鲎试剂是根据美国标准内毒素EC-5来标定的,因此灵敏度用EU/ml来表示。如果浓度在标准曲线内可对内毒素进行定量。生物来源的水或材料如果提纯未完成，可能含有可测量水平的内毒素。确定的内毒素含量应与内毒素限值比较来评估其特征。
使用适当的条件，ACC的有效范围从100-0.001 EU/ml。影响标准曲线范围的选择的因素包括 A） 分析仪器的参数，B）回归模板的选择，和C）分析试剂和实验室用具的质量
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