简介

        土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法，是研究土壤微生物生态学的基础，也是获是土壤中各种基因资源的一种有效手段。宏基因组学又叫环境基因组学（Environmental Genomics）或群体基因组学（Community Genomics），定义为利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的有机体群落，而不需要分离、培养单一种类的微生物。研究环境基因学的前提就是要获得质量足够好的DNA，由于土壤微生物往往会与土壤其他组分紧密结合，这就增加了提取土壤DNA的难度。常用的方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法是将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，使其释放DNA，继而抽提纯化；间接提取法是首先去除土壤等杂质，通过不同的离心速度从土壤中分离出细胞，然后对细胞进行抽提。直接提取法提取的DN**段较小（1~50kb），提取率高，操作简单；间接提取法提取的片断较大（20~500kb），纯度高，但操作繁琐，有些微生物在分离过程中会丢失得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，目前已经很少研究者会采用这种方法。
        直接法纯化土壤DNA最大的难点是如果有效除去与核酸分子非常相似的腐殖酸，因为痕量的腐殖酸的存在对后续的实验影响严重，比如PCR失败等。传统的纯化方法几乎不能有效除去腐殖酸，GBCBIO Technologies公司经过技术公关，在如何有效除去腐殖酸等抑制因子上取得重大突破，研发出高效的腐殖酸吸附剂，能够彻底除去腐殖酸等抑制因子，腐殖酸吸附剂是添加在裂解的过程中，后续的纯化采用硅胶柱的方式，因而操作上更简单，无繁琐的操作。GBCBIO公司的土壤DNA提取试剂盒能与进口MOBIO公司的相媲美。

实验流程：

1. 称0.3-0.5g土壤置于2ml离心管中，加入0.4g Glass Beads，再加入780μl Buffer C1与100μl Buffer C2。涡旋器高速震荡3-5min。

注意：Buffer C2是我司独特的腐殖酸除去剂，100μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤， Buffer C2的量可以适当增加，但不能超过250μl，否则会严重影响DNA的得率。

2. 加入100μl Buffer C3（C3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），涡旋混匀。70℃水浴处理10min。期间振荡几次。

注意：如果要纯化革兰氏阳性菌的DNA，请在70℃处理完后，再90℃水浴处理2min。

3. 12000 rpm(~13000×g)离心1钟，转650μl上清到1.5ml离心管中，加入150μl BufferC4混匀。

4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)离心1钟。

5. 转移上清到新的2ml离心管中，加入0.7倍的异丙醇，颠倒混匀，12000 rpm(~13000×g)离心2钟。

注意：如果是DNA含量很低的土壤样品，建议离心前-20℃放置1小时。

6.倒掉上清，倒置离心管于吸水纸上30-60秒。加入100μl灭菌去离子水，再加入350μl Buffer C5（必须把Buffer C5混匀后再吸取），涡旋混匀，70℃水浴放置数分钟，至沉淀完全溶解即可。

7. 12000 rpm(~13000×g)离心1钟，400μl转移上清到新的1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，混匀。

8. 将上一步所得溶液加入到GBC吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30秒，倒掉滤过液重新套回收集管。

9. 向GBC吸附柱中加入500 μl Buffer WB，12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30 秒，倒掉废液，将GBC吸附柱放入收集管中。

10. 向GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30 秒，倒掉废液，GBC吸附柱放入收集管中。

11. 向GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30秒，倒掉废液，将GBC吸附柱放入收集管中。

12. 12,000 rpm(~13,000×g)离心2 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

13. 将GBC吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 μl 洗脱缓冲液TE或灭菌去离子水，室温放置2-5 分钟，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 分钟，将溶液收集到离心管中。

注意：为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2 分钟，12,000 rpm(~13,400×g )离心2 分钟。洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH 值低于7.0 会降低洗脱效率；且DNA 产物应保存在-20℃，以防DNA 降解。

实验结果

腐殖酸吸附剂（Buffer C2）使用效果比较
在土壤样品裂解时，比较加与不加Buffer C2的所获得的裂解液澄清度。从上图看，加有Buffer C2的样品，颜色明显浅很多，说明Buffer C2对出去腐殖酸、色素等效果明显。
1,2：裂解时加入Buffer C2
3,4： 裂解时未加Buffer C2

裂解液加Buffer C4进一步沉淀除杂效果：
上一步获得的裂解液上清加入Buffer C4进一步处理，沉淀离心除杂，裂解时加有Buffer C2(腐殖酸吸附剂）的，再经Buffer C4处理几乎不再有颜色，而不加Buffer C2的颜色还很深。
1,2：裂解时加有Buffer C2
3,4：裂解时不加Buffer C2
 

 
1, 2: SDS高盐酚氯仿抽提法
3, 4: 使用Soil DNA Kit提取
1, 3: 为花基土壤
2, 4: 河边淤泥
  
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