简介

 T 细胞在免疫细胞介导的靶向肿瘤治疗中起到重要作用。使用体外活化扩增的 T 细胞进行过继性免疫疗法正在成为临床环境中治疗癌症的有力工具。多篇报道指出了使用含有各种细胞因子（如 IL-2， IL-7，和 IL-21）可用于 T 细胞的活化和扩增。血清补充剂（如人自体血浆）是 T 细胞体外活化与扩增的重要添加剂。在本研究中，我们利用白细胞介素 -2（IL-2），抗人 CD3 抗体和抗人 CD28 抗体展示了康宁 88- 581-CM 培养基对人 T 细胞体外活化与扩增的应用。同时研究了使用含有或不含 2% 人自体血浆的康宁 88-581-CM 培养基体外培养人 T 细胞的相关结果。

材料和方法

  外周血单核细胞（PBMC）的制备

外周血单核细胞使用康宁淋巴细胞分离液 (LSM)(Corning  Cat.No.25-072-Cl)，按照产品使用说明提供的操作方法，从人源新鲜的外周血中分离获得。获得的外周血单核细胞用不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤三次，离心去除多余的淋巴细胞和少量的残留的红细胞。离心参数设置如下： 第 1 次： 室温，1500 rpm/min，10min；第 2 次：室温，1200 rpm/min，10min；第 3 次：室温，1000 rpm/min，10min。

  人 T 细胞的体外扩增

  通过免疫磁珠分选 CD3+ T 细胞，使用 EasySep™人 T 细胞分离试剂盒 (STEMCELL Technologies Cat. No. 17951) 从新鲜 PBMC 中分选人 CD3+ T 细胞。将 CD3+ T 细胞 (1×106 个细胞 / mL) 悬浮于含有 1µg/mL 抗人 CD28 抗体和 200 IU/mL IL-2 (Corning Cat. No. 354043) 的含有或不含自体血浆的Corning 88-581-CM 培养基中。将含有 2×106 个细胞的细胞悬液接种到用 5µg/mL 抗人 CD3 抗体预包被的 6 孔细胞培养板 (Corning Cat. No. 3516) 中的一个孔中，并在 37℃，5% CO2 的恒温的培养箱中培养 3 天。在第 4 天至 14 天，添加含有或不含人自体血浆的 200 IU/mL IL-2 的新鲜 Corning 581- 88-CM培养基将细胞密度维持在5×105 至2×106 个细胞/mL 之间。每天观察细胞形态，培养至14 天， 离心收获细胞。

 表型分析

 在第 0 天和第 14 天收集 T 细胞样品，利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行鉴定分析。本研究中， 我们通过检测两组T  细胞表面标记物（CD3+/CD8+、CD4+/CD45RO-）的表达水平来评价体外扩增后的 T 细胞质量。具体操作参考 BD 提供的流式细胞检测标准流程， 不同标记的细胞表面标记物抗体， 按 1:1 抗体 /105 细胞的比例，4℃避光孵育 15min 后，PBS 洗涤后利用 300uL PBS 重悬细胞并用流式细胞仪进行表性分析，同型对应抗体作为对照。

结果

 将人 T 细胞在含有和不含 2% 人自体血浆的康宁 88-581-CM 培养基中培养两周。培养过程中出现细胞团簇与血浆的有无并无直接关系。图 1 的结果表明补充含有 2% 血浆的细胞比在不含血浆的培养基中培养的细胞形成更多的细胞团簇。

 含有 2% 自体血浆的康宁 88-581-CM 培养基

 当人 T 细胞在含有 2% 血浆的康宁 88-581-CM 培养基中培养时，到第 10 天时细胞会迅速增殖 100 倍至超过 1 亿个细胞。 第 14 天收获时，细胞已经扩增了 250 倍约 6 亿个细胞。相比不加血浆的康宁
88-581-CM 培养基，添加 2% 的自体血浆的 88-581-CM 培养基可明显增加T 细胞的体外扩增能力（如图 2）。

图 1. 培养第 10 天细胞形态 (A) 含有 2% 自体血浆的康宁 88-581-CM 培养基中培养的细胞。 (B) 不含血浆的康宁 88-581-CM 培养基中培养的细胞。 。

 图 2. 使用含有 2% 人自体血浆的康宁 88-581-CM 培养基的细胞生长和倍数扩增。不含自体血浆的 Corning® 88-581-CM 培养基为了评估不含自体血浆的康宁 88-581-CM 培养基的扩增结果，我们将其与竞争品牌 G 同时进行 T 细胞的无血清体外扩增，并比较其扩增结果。当T 细胞在不额外添加血浆的培养基中培养至第 14 天时， 细胞产量（~2×108 个细胞）和扩增倍数（~100 倍；如图 3）两者没有显着差异。接下来我们评估了康宁 88-581-CM 培养基在特定 T 细胞亚型扩增中的应用。CD8+T 细胞能够杀死癌细胞和病毒同时产生细胞因子，足够数量的初始 T 细胞对于病原体的连续应激反应是必不可少的。使用康宁 88-581-CM 培养基培养后，CD8+T 细胞和初始 T 细胞比例分别为 90.9% 和 5.3%，高于竞争品牌 G 培养基（分别为 89.1% 和 1.4%；如图 4）。

图 3. 细胞在康宁 88-581-CM 和竞争品牌 G 培养基中无血清培养 14 天增殖能力的比较。

图 4. 细胞在康宁 88-581-CM 培养基和竞争品牌 G 培养基扩增 T 细胞的表型分析。CD3+/CD8+ 为CD8+T 细胞；CD+/CD45RO- 为初始 T 细胞。此外，我们也评估了扩增 2×108 个 T 细胞所需的培养基总成本。康宁 88-581-CM 培养基的成本非常具有优势。在中国地区，其仅为竞争品牌 G 培养基成本的三分之一。

结论

康宁 88-581-CM 培养基可以在无血浆或低自体血浆条件下成功活化和扩增 T 细胞，获得高表达的CD8+ T 细胞和初始 T 细胞。虽然康宁 88-581-CM 培养基与竞争品牌 G 的培养基之间在 T 细胞增殖能力上没有显著差异，但在效应 T 细胞的比例上有明显优势，且成本更低，为研究人员提供了更好的选择。

保修/ 免责声明：除非另有规定，所有产品仅供研究使用。不适用于诊断或治疗程序。不适用于人类。康宁生命科学从未声称这些产品可以用于临床或诊断应用。

Corning® KBM 581 淋巴细胞无血清培养基

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