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细胞培养的污染检测、预防与去除

作者:admin 来源:本站 发布时间: 2019-03-17 21:57  浏览次数:
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在培养细胞过程中,最让人忧的事情就是细胞发生污染,为了应对细胞污染的问题,主要从两方面入手,一是预防,二是发生污染后的补救措施。

    然而,应对不同细胞污染有不同的措施,其中,培养细胞的污染主要包括真菌污染、细菌污染、支原体污染、病毒污染、化学物质的污染、不同细胞之间的污染,接下来,就按照不同类型的细胞培养污染给出相应的鉴定、预防和污染去除方法。


 

一. 真菌污染

鉴定:污染培养细胞的真菌种类很多,常见的主要有:烟曲霉、黑曲霉、毛霉、白色念球菌、酵母菌等。真菌污染一般肉眼可见,短期内培养液大多不发生浑浊,但形成白色或浅黄色漂浮物。在倒置的显微镜下可见细胞之间有纵横交错的菌丝,值得注意的是,不要把培养皿外的菌丝误以为在培养液内,若发现有,及时用酒精棉球擦拭。

 

                                                            菌丝图(来源:互联网)

预防:真菌污染属于微生物污染,预防主要从空气、器材、操作、血清入手。

1.     减少空气流动,培养室和操作室要注意空气的消毒,工作时要戴口罩。

2.     细胞培养器材消毒要彻底,尽可能的做到定期消毒,大概一周一次,若培养液漏出,则应立即消毒。

3.     实验操作应有无菌观念,动作要符合规范,不使用污染的器具,瓶盖应封紧。

4.     血清生产和使用时可能受到污染,在使用前最好先检查血清是否被污染,使用过程中也要保证不被污染。

污染去除:发生污染后,可考虑采用制霉菌素25微克每毫升或酮康唑10微克每毫升进行处理。如果细胞为肿瘤细胞,也可以尝试用巨噬细胞和抗生素联合处理,即将同种动物腹腔巨噬细胞加入被污染的细胞中(巨噬细胞与污染细胞比例为100:1),再加入100微克每毫升的抗生素,逐日检测,直至检测不到微生物,巨噬细胞不具永生性,会在培养过程中逐渐消失。如果还是无法消除污染,该细胞为高价值的肿瘤细胞,则可以将肿瘤细胞接种与BALB/c裸鼠的颈背部(每只接种4×106细胞),接种3-5只,一个月后取瘤块进行原代培养。


二. 细菌污染

鉴定:常见的细菌污染有大肠埃希菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等。细菌污染后,培养液在短期内会变黄色,因为有大量酸性物质产生,而且会发生浑浊。必要时可取少量培养液涂片染色检查细菌种类,也可以向肉汤培养基中加入少量培养液,37℃培养检测是否污染。

 

 

 

 

                                                           大肠埃希菌图(来源:互联网)

预防:细菌污染属于微生物污染,预防手段与真菌污染相同,在这基础上,还可以在培养液上加入双抗,即各100单位/毫升的青霉素和链霉素。

污染去除:若发生污染,可尝试使用5-10倍常用抗生素剂量的冲击方法,加药作用24-28h,,再换常规培养基培养。如果细胞为肿瘤细胞,也可以尝试用巨噬细胞和抗生素联合处理,即将同种动物腹腔巨噬细胞加入被污染的细胞中(巨噬细胞与污染细胞比例为100:1),再加入100微克每毫升的抗生素,逐日检测,直至检测不到微生物,巨噬细胞不具永生性,会在培养过程中逐渐消失。


三. 支原体污染

鉴定:支原体是一类缺乏细胞壁的细胞,呈高度多形性,细胞培养中被支原体污染是比较常见的问题,因为污染来源太多,包括工作环境、操作者、血清、实验器材等,鉴定的方法如下。

1.     相差显微镜观察。其中可以采用直接观察或地衣红染色观察,直接观察时,位于细胞表面和细胞之间的暗色微小颗粒为支原体,但要与线粒体区分。

2.     荧光染色法。将细胞接种于盖玻片上,在细胞未长满前取出玻片,用不含酚红的Hank's液漂洗后,再用1:3醋酸甲醇固定10min,然后用生理盐水漂洗,置于用生理盐水配制的 Hoechst 33258(浓度为50ul/ml)中染色10min,荧光染料将支原体内的DNA着色,染色后用蒸馏水洗1~2min,滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴,然后置荧光显微镜下观察。镜下散于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点为支原体。

3.     电镜检查。制备电镜标本,用扫描电镜或透射电镜观察。

4.     DNA分子杂交检查。按试剂盒说明进行,检出率高,但方法较复杂。

5.     PCR。现有支原体PCR检测试剂盒销售,可按说明书检测支原体污染。

 

 

 

:支原体污染细胞荧光图

:无污染细胞荧光图

图片来源:互联网

预防:支原体污染属于微生物污染,预防手段与真菌污染相近,在此基础上,可用100微克每毫升的卡那霉素抑制支原体,但可能对细胞有所损伤,尽量不加抗生素。

污染去除

1. 抗生素处理:。用100微克每毫升卡那霉素清除培养物中的支原体污染。亦有将细胞培养瓶直放,瓶内装人含600ug/ml 卡那霉素的生长液至瓶颈部,37C孵育 18h,然后移人含200ug/ml卡那霉素的生长液,可成功处理支原体。金霉素对细胞毒性较卡那霉素大,常用浓度为100~200ug/ml。对卡那霉素、四环素有抗药性的支原体可用泰乐菌素处理,对培养细胞无不良影响,污染细胞以50ug/ml泰乐菌素处理6天,或连续处理2代,可长期有效地清除支原体污染。

2. 高热处理。因支原体和细胞对热的耐受性不同,将受污染的细胞41℃作用5~10h,最长达18h,可以破坏支原体,而细胞仅少许损伤,即可恢复。对温度敏感的细胞株不能采用这种方法。

3. 巨噬细胞和抗生素联合处理。将同种动物腹腔巨噬细胞加入被支原体污染的细胞中(巨噬细胞与污染细胞比例为100:1),再加入100ug/ml的抗生素,结合支持物方法培养逐日检查,直至支原体被巨噬细胞消除。

4. 鼠的传代培养。如果还是无法消除污染,该细胞为高价值的肿瘤细胞,则可以将肿瘤细胞接种与BALB/c裸鼠的颈背部(每只接种4×106细胞),接种3-5只,一个月后取瘤块进行原代培养。

5.  血清处理。将污染的细胞接种于含 10% 非灭活血清培养基中,孵育 6h后,去除了包括人-人杂交瘤在内的5种细胞系中污染的支原体,其中起作用的是补体成分。

6. 支原体去除试剂。用MRA处理细胞,每4天换一次液,连续处理15天。也有网友推荐MycoplasmaOUT™ Treatment试剂,用一天后,细胞恢复生长。


四. 病毒污染

 

有关病毒污染的资料不多,但一般认为病毒污染不影响细胞培养,通过PCR技术可以检测。不过病毒污染对生产疫苗是不安全的。因此,至今,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作的难题。有研究显示用伽马射线可清除牛血清的大部分病毒,现如今最值得期待的是下游工艺中除病毒过滤器的开发。


五. 细胞污染

 鉴定

1.     形态学鉴定。形态观察是辨认细胞最简单和最直接的方法,但我们也应意识到它有

一定的不足,因为其中多数细胞形态与不同培养环境对细胞形态的可塑性有关。例如,在单层汇合状态心部位生长的上皮细胞,一般形态规则,呈多角形,而且边缘清晰明确,而生长在小片边缘同样的细胞,形态就不规则,呈伸开状;如果发生转化,就会从小片上脱离,变为成纤维细胞样的形态。

2.     种属鉴定。染色体分析是区分物种的最佳方法。 同工酶电泳也是一种较好的诊断

检测方法,而且比染色体分析快,但需要合适的仪器和试剂。

3.     谱系或组织标记。如细胞表面抗原、中间纤维蛋白、酶类、分化产物,根据以上物

质的差异,运用流式细胞术等技术,鉴定是否发生细胞交叉污染。

4.     STR分型。

预防:1. 实验器材如吸管不能混用。几种细胞同时实验时,器材要做好专用标记。

2. 细胞培养液公用时,细胞吸管和细胞用液要分开,千万不能用细胞吸管直接吸取细胞培养液。吸取培养液的吸管尖端不要触及培养瓶瓶口,避免把细胞带到培养液瓶中,防止进行其他细胞培养操作时导致细胞污染。

3. 所有转来的细胞或自己所建的细胞系都要在早期留有充足的冻存样本备用,一旦发生细胞交叉污染,可以复苏早期冻存细胞来使用。

去除方法:解决细胞交叉污染的问题最好的方法就是进行单克隆化,前提是要保证原细胞株还存在。具体是通过有限稀释法实现单克隆化,然后运用鉴定手段确保不存在其他杂细胞,即可去除细胞交叉污染。


 

六. 化学物质污染


化学污染物质包括残存洗涤剂、细胞残余、有毒化学药品等,细胞直接接触物(如培养基、生长基质、培养皿)或间接接触物(如配制培养基的器皿、瓶塞、瓶盖等)若被化学物质污染,将有可能直接导致细胞的死亡。如果在污染早期可用PBS清洗、稀释有害化学物质。


综上所述

 

 

为了防止发生污染,预防是第一位的,而且要注意实验规范,尽量做到定期消毒,实验人员也要有防止污染发生的意识,遇到发生污染情况可运用上述的鉴定和去除方法,不过一切的去除方法都不如一个众所周知的习惯——保存无污染的细胞株,这才是最明智的做法。

 

图片来源:互联网

 

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