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慢病毒概述 慢病毒( Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae)，为RNA病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于对HIV-1的研究最广泛最深入，对其生物学特性最为了解，因此HIV-1来源的慢病毒载体已成为其中的代表。
图1 HIV-1 RNA结构图 HIV-1为双链RNA病毒，共有9个基因，如图1所示。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构，tat、rev为调节基因，vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因。其中，gag基因编码病毒的核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白；pol基因编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、蛋白酶，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性。rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平，tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。4个辅助基因编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序列（LTR），内含复制所需的顺式作用元件，如包装信号元件Ψ。 第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达env。载体质粒携带了5’端LTR，和全部5’端非翻译区域，另外还带有rev应答元（RRE）。包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。 第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因（vif、vpr、vpu和nef基因）。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。 第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。将rev基因单独放在一个包装质粒上。同时又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV-1基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。 慢病毒优点 1、宿主范围广包装病毒时用VSV-G基因代替了原病毒的env基因，宿主范围更广，如神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。 2、感染能力强慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，能感染绝大多数细胞，对一些难于转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞有较好的感染效率。 3、具有整合能力 慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，因此可用于构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞株，也可以用于制备转基因动物。
整体实验流程 慢病毒包装技术路线：
包装过程： （1)转染前一天，将细胞接种到100mm dish中，控制细胞转染时的密度为70-80%。 （2)转染前一小时取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。 （3)制备转染试剂和质粒的复合物： 将待转染的病毒载体质粒32μg（骨架质粒：穿梭质粒=1:1）溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。 将Lipofectmin2000转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。 将Lipofectmin2000转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNALipofectmin2000转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。 取出细胞培养板，将上面配好的DNA- Lipofectmin2000转染试剂复合体加入到细胞培养板中，做好标记，放回培养箱。 收毒： （1)转染48h后，第一次收毒，收集培养基至50ml离心管中，做上标记，并给细胞更换新鲜的完全培养基。 （2)转染72h后，第二次收毒，收集培养基至50ml离心管中，做上标记，丢弃细胞。 注：废弃的含病毒的培养基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121℃，30min）处理。 3.慢病毒纯化： （1)普通离心机：3500rpm，10min，RT离心后，上清马上倒入新的50ml离心管，0.45μm，过滤上清到超速离心管中。上清分装到12支超速离心管，两两对应配平衡，不够的体积可用不含血清的培养基配平。 （2)超速离心机：HITACHI，30,000rpm，2h，4℃，离心后，可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀，做上记号。在安全柜中，打开离心管，小心地弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，弃未去除干净的上清。每管根据沉淀量添加DPBS，80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀过夜。 （3)将同一种病毒，逐管收集法收集病毒到最后一管，再用100μl DPBS收集2次，全部收到1.5ml 离心管中，按要求分装病毒，标记（病毒名称，年-月-日）-80℃冰箱保存。 （4.）慢病毒滴度检测（Real time 定量PCR 法测定滴度）： （1)样品制备： （a)消化293T细胞，按1×105细胞每孔接种24孔板。 （b)细胞贴壁后（铺板后4~6h）加入病毒。 （c)12~20h后换液，去掉含病毒的培养基。 （d)感染后72h拍照记录荧光，收集细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。 （2)Real-time PCR 检测： Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 来自TAKARA。 (a)下列比例配置反应体系：
(b) 设定程序为两步法Real-Time 定量。预变性95℃，15s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。 (c) 制作熔解曲线。PCR 结束后， 在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s， 同时读取吸光值。
北京毕特博生物提供的慢病毒： 我们采用第三代4质粒慢病毒包装系统，生物安全性更高； 采用VSV-G包膜，宿主范围更广； 产生的慢病毒滴度高，可达108~1010TU/mL； 各种慢病毒穿梭载体可供选择：过表达、ShRNA、miRNA、Tet诱导表达载体等； 可带有荧光报告基因（GFP、RFP、mCherry、Luciferase等）和药筛标记基因（Puromycin、Neomycin、Hygromycin等），有多种启动子（CMV、PGK、CAG、Ubc等）可供选择； 3~4周内即可完成病毒包装服务。 运输和储存 对于长距离运输，应先将慢病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。 慢病毒载体在-80℃保存6个月，滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融（小于3次）。 使用前从-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其尽快溶解，操作过程应置于冰盒上进行。用不完的 毒可以暂时放在4℃冰箱中，但最好尽快用完。
北京毕特博生物技术有限责任公司 http://www.bitebo.com 400热线：400-833-9299 电话：010-82015225 传真：010-62015131 联系人：陈娉桦 QQ:358411186 E-mail:chenph1989@163.com |
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