技术服务

慢病毒技术服务

作者:admin 来源:本站 发布时间: 2017-09-26 21:46  浏览次数:
购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于1994年的毕特博生物 www.bitebo.com

 慢病毒概述

慢病毒( Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于对HIV-1的研究最广泛最深入,对其生物学特性最为了解,因此HIV-1来源的慢病毒载体已成为其中的代表。


 

图1 HIV-1 RNA结构图

HIV-1为双链RNA病毒,共有9个基因,如图1所示。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构,tat、rev为调节基因,vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因。其中,gag基因编码病毒的核心蛋白,包括基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白;pol基因编码病毒复制所需的酶,如反转录酶、整合酶、蛋白酶,env基因编码病毒的包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平,tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。4个辅助基因编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序列(LTR),内含复制所需的顺式作用元件,如包装信号元件Ψ。

第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表,该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代,3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分别构建在两个质粒上,一个表达gag和pol,另一个表达env。载体质粒携带了5’端LTR,和全部5’端非翻译区域,另外还带有rev应答元(RRE)。包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。

第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进,在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因(vif、vpr、vpu和nef基因)。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力,同时增加了载体的安全性。

第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。将rev基因单独放在一个包装质粒上。同时又增加了两个安全特性:一是构建自身失活的慢病毒载体,即删除了U3区的3′LTR,使载体失去HIV-1增强子及启动子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA;二是去除了tat基因,用异源启动子序列代替,这样原始的HIV-1基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

慢病毒优点

1、宿主范围广包装病毒时用VSV-G基因代替了原病毒的env基因,宿主范围更广,如神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。 

2、感染能力强慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,能感染绝大多数细胞,对一些难于转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞有较好的感染效率。    

3、具有整合能力  慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达,因此可用于构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞株,也可以用于制备转基因动物。

整体实验流程

慢病毒包装技术路线:

包装过程:

(1)转染前一天,将细胞接种到100mm dish中,控制细胞转染时的密度为70-80%。

(2)转染前一小时取出细胞培养板,去除原有细胞培养基,加入10ml的Opti-MEM培养基,将细胞放回培养箱。

(3)制备转染试剂和质粒的复合物: 

将待转染的病毒载体质粒32μg(骨架质粒:穿梭质粒=1:1)溶于Opti-MEM培养基,总体积为500μl,轻轻混匀,静置5min。 

将Lipofectmin2000转染试剂溶于Opti-MEM培养基,总体积为500μl,轻轻混匀,静置5min。 

将Lipofectmin2000转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中,边加边轻轻混匀后在室温放置20min,使DNALipofectmin2000转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。

取出细胞培养板,将上面配好的DNA- Lipofectmin2000转染试剂复合体加入到细胞培养板中,做好标记,放回培养箱。
6h后吸去培养基,PBS洗一次,加入10ml新鲜完全培养基培养。

收毒:

(1)转染48h后,第一次收毒,收集培养基至50ml离心管中,做上标记,并给细胞更换新鲜的完全培养基。

(2)转染72h后,第二次收毒,收集培养基至50ml离心管中,做上标记,丢弃细胞。

注:废弃的含病毒的培养基加入84消毒液(1:20左右),浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头,离心管,培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理,也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌(121℃,30min)处理。

3.慢病毒纯化:

(1)普通离心机:3500rpm,10min,RT离心后,上清马上倒入新的50ml离心管,0.45μm,过滤上清到超速离心管中。上清分装到12支超速离心管,两两对应配平衡,不够的体积可用不含血清的培养基配平。

(2)超速离心机:HITACHI,30,000rpm,2h,4℃,离心后,可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀,做上记号。在安全柜中,打开离心管,小心地弃上清,离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上,弃未去除干净的上清。每管根据沉淀量添加DPBS,80μl-120μl/管,用封口膜封住管口,4℃溶解沉淀过夜。

(3)将同一种病毒,逐管收集法收集病毒到最后一管,再用100μl DPBS收集2次,全部收到1.5ml 离心管中,按要求分装病毒,标记(病毒名称,年-月-日)-80℃冰箱保存。

(4.)慢病毒滴度检测(Real time 定量PCR 法测定滴度):

(1)样品制备:

(a)消化293T细胞,按1×105细胞每孔接种24孔板。

(b)细胞贴壁后(铺板后4~6h)加入病毒。

(c)12~20h后换液,去掉含病毒的培养基。

(d)感染后72h拍照记录荧光,收集细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。

(2)Real-time PCR 检测:

Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 来自TAKARA。

(a)下列比例配置反应体系:

 

(b) 设定程序为两步法Real-Time 定量。预变性95℃,15s,之后每一步变性95℃,5s,退火延伸60℃,34s,共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
Data collection and real-time analysis enabled.

(c) 制作熔解曲线。PCR 结束后, 在95℃变性1min。然后冷却至55℃,使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持30s, 同时读取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃           

                                  
服务流程:

 

客户提供

签订合同支付预付款

安提海拉生物服务

交付结果交付尾款

客户得到

目的基因序列信息

 

腺病毒载体构建

 

与合同对应的病毒量以及对照病毒

病毒载体要求

 

病毒包装纯化

 

详细的实验报告

其它要求

 

滴度测定等

 

 

 

 

 

 

 

 

 

厦门安提海拉生物提供的慢病毒:

我们采用第三代4质粒慢病毒包装系统,生物安全性更高; 

采用VSV-G包膜,宿主范围更广; 

产生的慢病毒滴度高,可达108~1010TU/mL; 

各种慢病毒穿梭载体可供选择:过表达、ShRNA、miRNA、Tet诱导表达载体等; 

可带有荧光报告基因(GFP、RFP、mCherry、Luciferase等)和药筛标记基因(Puromycin、Neomycin、Hygromycin等),有多种启动子(CMV、PGK、CAG、Ubc等)可供选择; 

3~4周内即可完成病毒包装服务。

运输和储存 

对于长距离运输,应先将慢病毒载体保存在-80℃,再采用全程干冰运输,以防滴度下降。 

慢病毒载体在-80℃保存6个月,滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品,进行实验前,重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融(小于3次)。 

使用前从-80℃取出病毒,立即放在37℃水浴锅中,轻轻晃动,使其尽快溶解,操作过程应置于冰盒上进行。用不完的

毒可以暂时放在4℃冰箱中,但最好尽快用完。

 

北京毕特博生物技术有限责任公司

http://www.bitebo.com

400热线:400-833-9299

电话:010-82015225

传真:010-62015131

联系人:陈娉桦

QQ:358411186

E-mail:chenph1989@163.com

购买进口仪器、试剂和耗材——就在始于1994年的毕特博生物 www.bitebo.com

所有试剂均用于科研      北京毕特博生物技术有限责任公司 版权所有
服务热线:010-82015225/400-833-9299 | 传真:010-62015131 | E-mail:info@bitebo.com
京ICP备0528556号   京公网安备11010802008747   Skypedhfjcn