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引言
自然杀伤（NK）细胞在识别和杀死肿瘤和病毒感染的先天免疫和后天免疫反应中扮演着关键的角色。因此，已有许多研究尝试研发在体外激活和扩增NK细胞的方法，以用于和免疫细胞相关研究，而目前的方法包括使用细胞因子、诱导因子以及饲养细胞1，其中细胞因子在调节NK细胞的活性中具有核心作用。据报道，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ被归类为NK细胞的细胞毒性 和增殖的活化细胞因子，能够增强NK细胞对各种肿瘤的细胞毒性作用2。然而，这些激活NK细胞的细胞因子组合仍需研究人员进一步优化。 康宁NK无血清培养试剂盒II中含有1瓶1 mL的包被培养基，1瓶50 mL的激活培养基，1瓶1,000 mL的扩增培养基和1个透气性细胞培养袋。前两个试剂专用于NK细胞的初期激活培养，扩增培养基和细胞培养袋则用于NK细胞后期扩增培养。NK激活培养基和扩增培养基均采用优质的试剂和符合目前的良好生产规范（cGMP）要求的原料制造。培养基中的蛋白质是可注射等级的血清白蛋白和重组人胰岛素。
NK培养试剂盒组分的应用概述
激活培养基：NKCC-1＋10%自体血浆（灭活） 扩增培养基：NKCC-2或NKCC-2＋5%自体血浆（灭活） 激活培养瓶：T-75培养瓶 （自备）+NKCC-3包被培养基 扩增培养瓶：可透气细胞培养袋或T-225培养瓶 （自备）
试剂和材料
淋巴细胞分离液（LSM，康宁目录编号：25-072-Cl） 不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐（PBS），1×（500 mL）（康宁目录编号：21-040-CV） T-75培养瓶（康宁目录编号：353024） T-225培养瓶（康宁目录编号：431082）
NK细胞的激活和扩增
包被T-75培养瓶（开始细胞培养的前1天） 1. 向15 mL离心管中加入13 mL的PBS及1 mL的NKCC-3用来制备包被培养基。 2. 将所有的包被培养基（14 mL）转移至T-75培养瓶中。 3. 将预包被的培养瓶在37℃下孵育4小时或置于冰箱（2-8℃）中隔夜孵育。 4. 使用T-75培养瓶前先使用移液枪弃掉包被培养基，再用PBS润洗两次。 5. 将T-75培养瓶置于室温下风干15分钟。
制备PBMC（第1天） 1. 将经抗凝处理的血液在室温下以400 ×g离心10分钟后，将血浆（上清液层）转移到新的离心管中。 2. 将自体血浆在56℃下加热灭活30分钟后于800 ×g下离心20分钟以去除沉淀物，将上清液血浆储存于4℃下，存储的自体血浆在接下来10天的细胞培养中使用。 3. 在血液样本中加入等体积的PBS作为已被丢弃的自体血浆的代替品用以维持细胞悬浮液的体积， 然后轻轻地重悬血液。 注意：在PBS中预先添加0.1％人血清白蛋白（HSA）有助于维持血细胞的活力。 4. 根据说明书使用淋巴细胞分离液（LSM）将外周血单个核细胞（PBMC）从上述血液样本中分离。注意：需采用新鲜的人体血液（收集后2小时内）以获得具更好的活性;请勿使用超过24小时抽取的血液。 5. 将PBMCs用含至少5xPBS（不含钙和镁）的体积洗涤后，在室温下于500 ×g离心10分钟，收集PBMCs。 注意：使用LSM可从1 mL的新鲜外周血中提取1x106个细胞；本NK细胞培养流程需要30 mL的外周血。
NK细胞的激活培养（第1-7天） 1. 在实验第1天向30 mL的NKCC-1培养基中加入自体血浆至最终浓度为10％，以制备激活培养基。 2. 将PBMCs悬浮于20 mL的激活培养基（含10％自体血浆的NKCC-1培养基）中，并将细胞密度调整为1×106个细胞/mL。 3. 将20 mL的PBMCs悬液转移至预先包被的T-75培养瓶后，放置在5% CO2，37℃的培养箱中培养2-3天。 4. 第3天或第4天根据PBMCs的细胞状态来添加10 mL的激活培养基，持续培养2天。 5. 在第6天将所有（30 mL）的PBMCs悬液收集到50 mL的离心管中，并在800 xg下离心5分钟。 6. 吸除上清液后向细胞培养袋中加入适量（例如130 mL）的含5％自体血浆的NKCC-2培养基， 并将细胞密度调整为5×105个细胞/mL后进行孵育培养。 注意：若加入的培养基体积小于100 mL，则将细胞培养于在T-75培养瓶中；若加入的培养基体积超过100 mL，则需将细胞转移至细胞培养袋或T-225培养瓶中培养。
NK细胞的扩增培养（第8-11天） 1. 每2到3天检测细胞的密度及活率，并根据细胞增殖状态加入新鲜的NKCC-2培养基，将细胞密度维持在5×105个细胞/mL的水平。 注意：建议在NK细胞扩增期间添加的新鲜培养基中补充0.5％至1％的自体血浆，直至其耗尽为止。 2. 第11天将NK细胞收集后进行细胞计数和流式细胞分析。 注意：若后续实验需要更高的细胞数量，可添加新鲜的581淋巴细胞无血清培养基（康宁目录编号:88-581-CM）来延长细胞的培养期。
参考文献
1. Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500. 2.Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.
北京毕特博生物技术有限责任公司
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