引言
自然杀伤（NK）细胞在识别和杀死肿瘤和病毒感染的先天和后天免疫反应中扮演着关键的角色。因此，已有许多研究尝试研发在体外激活和扩增NK细胞的方法，以用于和免疫细胞相关研究，而目前的方法包括使用细胞因子、化学试剂以及饲养细胞1， 其中细胞因子在调节NK细胞的活性中具有核心作用。据报道， IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ被归类为NK细胞的细胞毒性和增殖的活化细胞因子，并增强NK细胞对各种肿瘤的细胞毒性作用2。然而，这些激活NK细胞的细胞因子组合仍需研究人员进一步优化。
此应用说明描述了使用康宁NK无血清培养试剂盒II快速扩增NK 细胞的步骤，以及能验证该试剂盒的测试方法。该测试结果显示康宁NK无血清培养试剂盒II能为研究人员制备扩增能力强、细胞活力好以及细胞毒性高的NK细胞提供支持。
该NK无血清培养试剂盒II中含有1瓶1 mL的包被培养基，1瓶50 mL 的基础培养基，1瓶1,000 mL的扩增培养基和1个透气性细胞培养袋。前两个试剂被专门设计用于NK细胞的激活培养，而扩增培养基和细胞培养袋则被用于扩增NK细胞。NK激活培养基和扩增培养基均是采用优质的试剂和符合良好生产规范（cGMP）级的原料制造的。培养基中存在的唯一蛋白质是可注射等级的血清白蛋白和重组人胰岛素。
结果
NK细胞形态
树突状细胞附着在培养瓶表面上，而NK细胞经培养会形成较小的细胞团块。该细胞团块的体积会随着细胞密度的上升而增加。图1显示培养第10天后NK细胞在不同培养基中的形态。NK培养试剂盒和NK无血清培养试剂盒II的培养液中观察到的细胞团块远多于竞争产品I和竞争产品Y的培养基中观察到的细胞团块。
材料和方法
根据说明书使用淋巴细胞分离液（康宁目录编号：25-072-CI）将外周血单个核细胞（PBMCs）从健康供体的血液中分离。
将3×107个细胞/mL的PBMC悬浮于20 mL的激活培养基（含10％自体血浆的NKCC-1培养基）中后转移至预包被的T-75的培养瓶中， 随后置于含5% CO2的培养箱中在37℃下培养2-3天。T-75培养瓶在使用前均预先以NKCC-3培养基进行包被。
将10 mL的激活培养基（含10％自体血浆的NKCC-1培养基）加入该T-75培养瓶中后继续培养细胞2天直至细胞密度达到2x106个细胞/mL以上。
悬液在800 ×g下离心5分钟以收集所有PBMC细胞。将沉淀的细胞重新悬浮于含10%自体血浆的NKCC-2培养基中，再补充5%的自体血浆，并转移至细胞培养袋中培养。每2-3天检查细胞状态，并加入新鲜的NKCC-2培养基将细胞密度维持在5×105至1×106个细胞
/mL的范围内。培养14天后收集细胞进行细胞计数，同时利用BD AccuriTM C6流式细胞仪（BD Biosciences）分析细胞表面标志物
（CD3-/CD56+）的表达。此外，该NK细胞还通过CCK-8法，以K562作为靶细胞（效应细胞与靶细胞，即E/T的比率为5和10）检测其细胞的毒性杀伤能力。
图1. 培养10天后NK细胞的形态。培养于NK无血清培养试剂盒II、NK培养试剂盒、竞争产品I和竞争产品Y10天后的NK细胞。以上为随机选择的照片。比例尺：200 µm。
NK细胞的增殖和扩增
对于NK细胞的增殖，如图2和图3所示，NK细胞在分别利用NK无血清培养试剂盒II和NK培养试剂盒培养14天后扩增了230倍和200倍，总细胞数量分别为7 x 109个细胞和 6 x 109个细胞，比竞争产品I的培养试剂盒（只达到70倍的扩增）多了3倍。利用竞争产品Y的培养试剂盒培养的NK细胞呈比较差的扩增表现，这也与其细胞形态学观察结果一致。
NK细胞的表型
NK细胞的特异表面标志物为CD3-/CD56+。流式细胞的分析结果 显示使用NK无血清培养试剂盒II可获得86.7％的NK阳性细胞，而使用竞争产品I和竞争产品Y的培养试剂盒则获得相对较少的NK 阳性细胞（分别为66.1％和78.8％），数据如图4所示。
CCK-8细胞毒性
将5×105个及1×106个效应细胞（NK细胞）/mL分别与1×105个靶 细胞（K562细胞）/mL在96孔微孔板（100 µL）中混合后置于含5% CO2的培养箱中在37℃下隔夜共培养。分析前在每孔细胞均加入10 µL的细胞计数试剂盒8（CCK-8）试剂（Sigma目录编号：96992） 并进一步在37℃下孵育4小时后利用SpectraMax M4®（Molecular Devices）多功能微孔板检测仪读取吸光度数据。在E/T比例为5的状况下，康宁NK无血清培养试剂盒II与竞争产品I（70％）和竞争产品Y（60％）相比具有更强的细胞毒性（100％）。
图5.CCK-8法评估NK细胞对K562细胞的细胞毒性。该细胞毒性测定是在效应细胞（NK细胞）与靶细胞（K562细胞）的比例为5和10的情况下进行。
结论
 使用康宁NK无血清培养试剂盒II可快速激活扩增NK细胞，可获取数量大（~70亿细胞，即230倍的增殖），具有高细胞毒性效力（在E/T比例为5：1的状况下达到100％的细胞毒性效力）的NK细胞。
康宁NK无血清培养试剂盒II在无其他细胞因子（如IL-2）的条件下可以获取较高的NK细胞增殖。
康宁NK无血清培养试剂盒II具有一套完整的材料和详细的操作程序。
与竞争产品I和竞争产品Y的培养试剂盒相比，培养于康宁NK 无血清培养试剂盒II的NK细胞在生长、NK阳性细胞比率以及细胞毒性效力方面均表现出了更好的性能。
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附录
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项目 NK无血清培养试剂盒II
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NK培养试剂盒
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竞争产品I
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竞争产品Y
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4个组分:
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5 个组分:
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1个组分:
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8个组分:
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1L NKCC-2扩增培养基
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预包被的T75培养瓶
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NK培养基（2L/2瓶）
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NK培养基（2L/2瓶）
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50mL NKCC-1激活培养基
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1L的KBM NK扩增培养基
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NK诱导因子（6瓶）
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1 mL NKCC-3包被培养基
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50 mL的NK基础培养基
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项目 透气性细胞培养袋
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1.8 mL的基础添加试剂
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透气性细胞培养袋
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产品包装体积 1L
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1L
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1L
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2L
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PBMC的细胞接种数量 30 千万
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30 千万
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30 千万
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30 千万
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培养天数 14
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14
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14
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14
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细胞产量 ~6.9 亿
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~6.0 亿
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~2.1 亿
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~0.9 亿
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扩增倍数 230
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200
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70
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29.3
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CD3-/CD56+比例 86.70%
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67.10%
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66.10%
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78.80%
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效应NK细胞数量 ~5.9 亿
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~4.0 亿
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~1.4 亿
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~0.7 亿
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细胞毒性（E/T=5） 100%
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75%
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72%
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68%
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培养基使用体积 1.5L
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1.5L
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1.5L
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800 mL
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IL-2使用体积（1000IU/mL） --
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1.5 mL
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1.5 mL
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--
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自体血浆使用体积 9.5 mL
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22 mL
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3.5 mL
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3.6 mL
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参考文献
1. Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500.
2. Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.
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