【目录号】RAL48TS，RAL48T
【名称】
通用名称：内毒素检测试剂盒（基因重组荧光法）
英文名称：BioendoTM Recombinant Factor C Endotoxin Test Kit (Fluorescent Assay)
【用途】
用于体外检测革兰氏阴性细菌内毒素。不可用于疾病诊断。
【检测原理】
基因重组荧光法采用《中国药典》2020年版注射剂安全性检查法应用指 导原则“重组C因子法”检测细菌内毒素。使用基因重组技术，在真核 细胞表达鲎血细胞中与内毒素起反应的丝氨酸蛋白酶催化级联蛋白。其 中重组C因子与内毒素结合之后，由无活性的蛋白酶原转变成具有生物 活性的蛋白酶，识别并催化下游荧光底物产生荧光信号。荧光信号的强 度和内毒素浓度成正相关，通过与标准曲线的比较，计算出样品中内毒 素的浓度。
【储存条件及有效期】
2-8℃保存，有效期两年。
【注意事项】
（1） 该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁用于检测临床样本内毒素或作为诊断人类疾病的辅助工具，严禁试剂以任何途径进入机 体。
（2） 接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的，玻璃器皿和材料可以250℃，30分钟灭菌处理。试验过程应防止微生物的污染。
（3） 该说明书中的无热原指内毒素浓度小于0.001 EU/ml。
（4）供试品溶液和重组因子试剂混合后溶液的pH值应在6.0~8.0之间， 若超出此范围，需用无热原的缓 冲液、0.1N氢氧化钠或0.1N盐酸调节。
（5）塑料管不建议用于内毒素稀释，稀释的内毒素溶液静置时间超过 10分钟，用前在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟，放置4小时以上的内毒素 溶液应丢弃。
（6） 重组因子试剂必须用配套的检测缓冲液溶解；不要用旋涡混合器剧烈振摇；溶解的重组因子试剂应在10分钟内使用；若采用多道移液器， 将溶解的重组因子试剂转移到无热原加样槽，并轻轻摇匀。
（7） 检测软件相关参数可以根据《质检报告》进行设定，也可以根据实际情况在范围内进行调整，以给出标准曲线的相关系数最佳为宜。
【样本采集和保存】
样本采集时必须小心操作以避免微生物或内毒素污染。试验所用的器皿 需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法
（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查 的适宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头 等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
样本应储存于细菌不会繁殖或内毒素水平不会改变的条件下。比如，样 本可以2~8℃临时存储（不到24小时），或-10℃以下长期存储（24小时 以上）。适当的容器和存储条件需用户自行验证。
【供试品溶液的制备】
某些样本需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要 时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和重组因 子试剂混合后溶液的pH值在6.0~8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、 碱溶液 或缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去
除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
【内毒素限值的确定】
药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：
L= K / M
式中 L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表 示，注射剂K=5 EU/（ kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h）， 鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）； M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按 1.62m 计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积2 剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
【确定最大有效稀释倍数（MVD）】
最大有效稀释倍数数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检 测。用以下公式来确定MVD：
MVD = c L /λ
式中 L为供试品的细菌内毒素限值；
c为供试品溶液的浓度，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml。如需计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=λ/L； λ为所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
【用法】
1. 试剂与器材
1.1 试剂
重组因子试剂、检测缓冲液、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水。
1.2 器材：
无热原试管、无热原吸头、无热原96孔微孔板（或可拆式板条）； 旋涡混合器、移液器、试管架；
带温育系统的荧光微孔板读数仪器及配套软件。
2. 实验方法 2.1荧光测定仪器的程序及模板设定
以荧光微孔板读数仪FLUOROSKAN为例： (1)温度设定：孵育温度37ºC。 (2)振板设定：中速、振板15秒
(3)读数波长设定：当使用荧光微孔板读数仪FLUOROSKAN时，推荐使用激发波长355nm/发射波长460nm。读取反应开始和30分钟时的荧光信号仪。
2.2 内毒素标准溶液配制
为了计算未知样品中内毒素浓度，每个试验必须引用一个有效的标准曲线。
用标准内毒素配成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用重组因子试剂的标示检测限。
（1）取细菌内毒素工作标准品1瓶，开启后加入适量细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇15分钟，配制浓度为50EU/ml的内毒素标准品溶液。
（2）取无热原试管4支并标记，细菌内毒素检查用水作稀释液，将50EU/ml的内毒素标准品溶液依次梯度稀释，配制为5.0EU/ml、0.5EU
/ml、0.05EU/ml和0.005EU/ml等4个浓度。各个浓度内毒素标准品稀释液配制时，均应在旋涡混匀器上混匀至少1分钟。内毒素标准品稀释液的配制可参考下表：
|
内毒素浓度
（EU/ml）
|
稀释液体积
（ml）
|
加入内毒素浓度
（EU/ml）
|
加入内毒素体积
（ml）
|
|
5.0
|
0.9
|
50
|
0.1
|
|
0.5
|
0.9
|
5.0
|
0.1
|
|
0.05
|
0.9
|
0.5
|
0.1
|
|
0.005
|
0.9
|
0.05
|
0.1
|
上表提出了一种适用于试剂盒的细菌内毒素工作标准品配制系列浓度内毒素标准品溶液的方案。并非所有的内毒素标准品溶液都必须用于生成标准曲线。可以使用替代稀释方案，也可以使用其他确定效价的内毒 素。用户可以根据具体的产品需求选择标准曲线范围。数据表明，特定范围标准曲线可以提高测试样本内毒素预测值的准确性。
2.3 重组因子试剂溶解
重组因子试剂是由真核细胞表达的重组因子蛋白和荧光基质制备的冷冻干燥品。使用前，每瓶重组因子试剂必须按标示量用配套的检测缓冲 液。如果使用量超过一瓶，将两瓶或更多瓶分别复溶，混合后轻轻摇 匀，静置至溶液澄清后使用。
2.4 实验操作
（1）预热荧光微孔板读数仪FLUOROSKAN，设置检测温度为 37℃。
（2）取无热原黑色微孔板或所需数量的黑色微孔板条，微孔板条装至 微孔板架上。相应孔中分别加入细菌内毒素检查用水（作为阴性对 照）、内毒素标准品溶液或稀释液，供试品溶液等各100μl，分别2~3个重复。
（3） 微孔板放入预热的荧光微孔板读数仪FLUOROSKAN中， 37℃孵育至少10分钟。
（4） ） 取出微孔板， 每孔小心加入50μl重组因子试剂（避免产生气泡!）。
（5） 将微孔板放入荧光微孔板读数仪FLUOROSKAN中（不要盖上微孔 板盖！），点击检测软件界面“确定”按钮，运行检测程 序。
（6）检测程序结束后，进行数据处理和数据分析。
3. 数据处理
（1）设定读数之前震荡15s，随后静置孵育3min；读数之后，孵育总时长30min；
（2）设定激发波长355nm，发射波长460nm。
（3）建立标准曲线
Lg（Y）= A* lgB +a，其中：Y为30min中荧光值减去起始的荧光值，B 为内毒素的浓度，A为直线斜 率，a为Y轴截距。
（4）使用软件可以线性回归自动计算出结果。
（5） 如果线性相关系数|r|≥0.980，则可以建立多项式模型制作标准 曲线，计算样品内毒素浓度。
（6）当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：
① 标准曲线的浓度点≥3，线性相关系数|r|≥0.980；
② 标准曲线最低点的荧光值大于阴性对照的荧光值；
③ 供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。
【供试品的干扰试验】
1. 以下情况需进行供试品的干扰实验：
（1）当对新药或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，必须进行干扰试验；
（2）当试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变，或试验环境中发 生了任何有可能影响试验结果的变化时，必须重新进行干扰试验；
（3）当供试品中可能存在对内毒素检测试验的干扰物质时，须进行干扰试验。
2. 干扰实验：
（1）选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度，如采用标准曲线为50，5， 0.5，0.05，0.005EU/ml系列时，可以用供试品配制0.5EU/ml内毒素浓 度作为实验的供试品阳性对照。
（2）用供试品溶液配制浓度为λm的内毒素溶液（即含λm内毒素的供
试品阳性对照），测量出该溶液的内毒素浓度，称为Cs。
（3）测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度, 称为C t。
（4）计算该试验条件下的回收率：R =（Cs –Ct ）/ λm × 100％。
（5）当R在50％～200％之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在明显干扰作用。
（6）当R在50％～200％之外，需对供试品进行系列稀释或进行其它处 理消除干扰，每一稀释溶液都重复步骤2~4，直到内毒素的回收率在50％～200％之间。选择回收率最接近100％的稀释倍数进行内毒素检 测。
【参考文献】
1. Bang, F.B. A bacterial disease of Limulus polyphemus. Bull. Johns Hopkins Hosp. 98:325 (1956).
2. Levin, J. and F.B. Bang. The role of endotoxin in the extracellular coagulation of Limulus blood. Bull. Johns Hopkins Hosp. 115:265 (1964).
3. Levin, J. and F.B. Bang. A description of cellular coagulation in the Limulus. Bull Johns Hopkins Hosp. 115:337 (1964).
4. Levin, J. and F.B. Bang. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19:186 (1968).
5. Solum, N.O. Some characteristics of the clottable protein of Limulus polyphemus blood cells. Thromb. Diath. Haemorrh. 23:170 (1970).
6. Solum, N.O. The coagulogen of Limulus polyphemus hemocytes. A comparison of the clotted and non-clotted forms of the molecule. Thromb. Res. 2:55 (1973).
7. Young, N.S., J. Levin, and R.A. Prendergast. An invertebrate coagulation system activated by endotoxin: Evidence for enzymatic mechanism. J. Clin. Invest. 51:1790 (1972).
8. 2020年版《中华人民共和国药典》—— 1143细菌内毒素检查法
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